Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에
2011년 12월 27일
조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.
이 절차의 전반적인 목표는 성체 제브라피시 망막에서 특정 단백질의 발현을 억제하거나 녹다운하는 것입니다. 이것은 먼저 물고기 눈의 바깥쪽 각막을 제거함으로써 이루어집니다. 다음으로 눈의 각막 안쪽에 작은 구멍을 만듭니다.
그런 다음 유전자 특이적 모르포를 유리체에 주입합니다. 마지막으로, 모르포는 망막 세포로 전기천공됩니다. 궁극적으로, 망막 조직 절편의 면역형광 현미경 검사 또는 면역 블로팅을 통해 표적 단백질 발현이 감소했음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
이 기술의 의미는 색소성 망막염과 같은 망막 퇴행성 질환 치료로 확장됩니다. 손상된 망막에서 Mueller 신경교세포 증식의 기저에 있는 메커니즘을 밝힐 수 있는 잠재력 때문에, 우리는 인간의 망막에 대한 손상에서 유사한 반응을 유도할 수 있는 방법을 찾을 수 있을 것입니다. 이 방법은 성체 제브라피시 망막의 망막 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 광형질전환이나 시각적 처리에서 특정 단백질의 역할과 같은 망막의 다른 과정에 대한 정보를 제공하기 위해 약간 수정될 수 있습니다.
Ryan Tummel 박사가 박사후 연구원으로 재직할 때 개발한 절차를 시연합니다. 제 연구실에는 현재 박사후 연구원인 Travis Bailey 박사가 있을 것입니다. 물고기로 작업하기 전에 300NMO의 Morpho를 100마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물 청록색으로 3밀리몰 용액으로 희석하여 세포에 전기천공할 수 있는 양전하를 띤 리사민 태그가 붙은 모르포스를 준비합니다.
바깥쪽 각막층을 제거하려면 6-12개월 된 제브라피시를 트리카 1밀리리터당 1밀리그램 또는 제브라피시 수조에 페스 에탄올 2개로 마취시키고 젖은 종이 타월로 제브라피쉬를 아가미를 덮고 눈은 노출시키지 않습니다. 감싼 물고기를 입체경 아래에 놓고 눈의 직경이 시야의 약 1/3을 채울 때까지 배율을 높입니다. 다음으로, Dumont 5번 핀셋을 사용하여 눈이 빠지는 것을 방지하기 위해 약간 돌출된 부분이나 입술 부위의 시신경 균열 근처의 바깥쪽 각막을 잡습니다.
각막을 제거할 때는 다른 핀셋으로 고정하십시오. 그런 다음 눈을 가로질러 낮은 각도로 당겨 각막을 제거합니다. 바깥쪽 각막을 제거한 직후, 사파이어 블레이드 메스를 사용하여 동공이 홍채 부하와 만나는 각막을 작게 절개합니다.
5마이크로리터의 모르포 용액을 33게이지 탈착식 무딘 끝 바늘이 장착된 Hamilton 주사기에 넣습니다. 라인에서 공기가 잘 통하는 것을 제거하기 위해 위아래로 파이프를 연결하십시오. 절개 부위를 통해 유리체에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다.
망막에 구멍이 나거나 수정체가 변위되지 않도록 바늘을 너무 많이 삽입하지 마십시오. 모르포 용액을 황산염 공간에 천천히 주입합니다. 무색 유리체는 모르포 용액에 의해 치환될 때 절개 부위에서 누출됩니다.
절개 부위에서 소량의 모르포가 새어 나올 때까지 주사합니다. 리사민 태그가 붙은 모리노는 눈 안쪽이 명확하게 보여야 합니다. 주입 후 물고기를 수조로 되돌려 다른 쪽 눈을 unin 주입 제어로 사용하여 회복하고 electroporation 매개변수를 75볼트에서 두 개의 연속 50밀리초 펄스로 설정합니다.
약 10마리의 물고기를 주입한 후 펄스 사이에 1초간 멈춥니다. 주입된 물고기를 다시 마취하고 젖은 종이로 감쌉니다. 수건은 아가미를 덮고 눈은 노출시킵니다.
마취제로 채워진 페트리 접시에 생선을 옮깁니다. 장갑을 낀 손으로 마취가 채워진 접시 바닥에 생선을 부드럽게 잡고 눈이 완전히 잠기도록 주의하십시오. 등쪽 망막을 대상으로 하려면 눈의 복부 절반에 있는 양극을 아래쪽으로 부드럽게 눌러 눈이 회전하여 안구의 등쪽 부분을 노출시키면서 복부 쪽을 계속 누르고 음극을 노출된 눈의 등쪽 절반에서 0.5-1mm 떨어진 곳에 놓습니다.
음극을 눈에 직접 대면 등쪽 망막이 손상될 수 있으므로 피하십시오. 전극 사이의 적절한 거리를 결정한 후 전극 손잡이의 나사를 조정하여 후속 전기천공을 위해 일정한 확산을 유지하십시오. 눈을 전기천공하고 물고기를 신선한 수조물이 담긴 수조로 되돌려 보내 즉시 소생시키고, 물고기를 지속적인 빛으로 인한 망막 변성과 같은 망막 유전자 발현의 변화를 일으키는 절차를 시행했습니다.
망막이 등쪽 배쪽 축에서 코에서 측두로 분리될 때, 음영 처리된 파란색 상자는 전기천공법 자체로 인해 가장 자주 손상되는 망막 영역을 나타냅니다. 음영 처리된 분홍색 상자는 전기천공법에 의해 망막 세포로의 형태 도입을 목표로 하는 영역을 나타냅니다. 전기천공법 후 3일 후 오른쪽 이미지에서 볼 수 있듯이, 리사민 표지는 간상체 외분절(rod outer segments), 외핵층(outer nuclear layer), 간질층(interclear layer) 및 신경절 세포층(ganglion cell layer)을 포함하여 절편화된 망막의 모든 층과 세포 유형에서 여전히 시각화됩니다.
좌측에 있는 공백 심상은 unin에 의하여 주사된 눈에서, 어떤 lissamine 표기된 morino든지 결여된, 가득 차있는 단백질 녹다운은 morpho의 효험에 따라서 electroporation 후에 3 5 일을 통해 달성될 수 있습니다입니다. 이 예에서는 음성 대조군 모르포 또는 A-P-C-N-A 모르포를 망막에 전기천공하고 1일, 2일 또는 3일 동안 빛에 노출된 후 망막을 제거한 다음 조직을 처리하고 항 PCNA 항체로 면역염색했습니다. 3개의 대조 망막 모두에서 많은 PC NA 양성 세포가 녹색으로 관찰되었지만, 모르핀 망막에서 PCNA 발현이 현저히 감소했습니다.
이 기술을 마스터하면 한 시간에 약 20마리의 물고기에 대해 절차를 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 이 절차에 따라 전극을 물고기의 눈에 직접 만지지 않도록 하는 것이 중요합니다. 면역조직화학(immunohistochemistry), 제자리(situ to hybridization), 실시간 PCR 및 면역 블로팅(immuno blotting)과 같은 다른 방법을 사용하여 망막 재생에 필요한 유전 경로와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.
개요
이 기사는 반의미 모폴리노를 사용하여 성인 제브라피쉬 망막에서 표적 단백질의 발현을 조건부로 억제하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 망막 재생 및 기능에서 단백질의 역할 연구를 가능하게 하는 망막 내 주입 및 전기 침투를 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 재생 의학
배경
- 망막에서 단백질 기능을 이해하는 것은 망막 질환에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다.
- 제브라피쉬는 재생 능력으로 인해 모델 유기체로 사용됩니다.
- 조건부 억제 기술은 망막 복구 메커니즘을 규명할 수 있습니다.
- 이 방법은 망막 퇴행성 질환을 표적으로 하는 치료법에 영향을 미칠 수 있습니다.
연구 목적
- 제브라피쉬 망막에서 특정 단백질 발현을 억제합니다.
- 망막 재생에서 단백질의 역할을 탐구합니다.
- 다른 망막 과정에 적용할 수 있는 기술을 개발합니다.
사용된 방법
- 제브라피쉬 눈의 외부 각막 제거.
- 유리체 내 유전자 특이적 모폴리노 주입.
- 망막 세포로의 모폴리노 전기 침투.
- 면역형광 현미경 및 면역 웨스턴 블로팅을 통한 단백질 억제 평가.
주요 결과
- 표적 단백질 발현의 성공적인 억제 관찰.
- 망막층에서 모폴리노 분포의 시각화.
- 모폴리노 처리된 망막에서의 PCNA 발현 감소.
- 이 기술은 여러 물고기의 신속한 처리를 가능하게 합니다.
결론
- 이 방법은 망막 생물학 연구를 위한 귀중한 도구를 제공합니다.
- 얻은 통찰은 망막 질환에 대한 치료 전략을 알려줄 수 있습니다.
- 추가 적응은 다른 망막 기능에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Conditional protein knockdown in the adult zebrafish retina enables target validation in a disease-relevant regenerative model, supporting mechanistic de-risking for retinal degenerative disease programs. This approach provides predictive confidence in protein function prior to lead identification, particularly for pathways governing Müller glia activation and neuronal progenitor dynamics. The method aligns with early discovery workflows requiring functional validation in a vertebrate system with translational continuity to human retinal biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling temporal control of protein knockdown during defined stages of retinal regeneration.
- Operational Value: Supports pathway clarification through loss-of-function analysis in a robust regenerative context.
- Scientific Value: Enhances target confidence by linking protein activity to progenitor proliferation and differentiation outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay development by establishing reproducible knockdown efficiency.
- Operational Value: Enables quantitative readouts via immunofluorescence and immunoblotting to support assay standardization.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by allowing assessment of protein roles in visual transduction and processing in intact retinal circuits.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by modeling human retinal degeneration mechanisms in a vertebrate regeneration paradigm.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment through correlation of knockdown effects with PCNA+ progenitor dynamics.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by de-risking targets involved in glial-mediated repair.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling functional assessment of candidates in a regenerative retinal context prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by permitting stage-specific protein knockdown during regeneration.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized electroporation and visualization of lissamine-tagged morpholino distribution.
- Analytics: Generates quantitative measurements via immunofluorescence and immunoblotting to compare knockdown efficacy across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking knockdown phenotypes to human-relevant retinal repair mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiple target interrogations across regeneration stages and retinal processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through conditional, temporal knockdown in a regenerative model.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined electroporation parameters and lissamine visualization.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in retinal repair pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and electroporation techniques.
- Dependent on specialized instrumentation including electrode forceps and programmable pulse generators.
- Necessitates cross-team standardization for consistent morpholino preparation and delivery.
- Involves adaptation considerations when extending to other retinal processes such as phototransduction.
- Practical limitations include tissue damage risk from improper electrode placement and variable knockdown duration based on morpholino efficacy.
