표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

이 비디오 기사는 플라스미드를 암세포에 전달하기 위한 표적 고분자 나노입자 시스템인 합성(synthesizing) 절차를 보여줍니다. 먼저 folated gelatin polymer가 합성되고 EGFP를 인코딩하는 DNA plasmid가 캡슐화됩니다. 다음으로, folated 나노 입자를 pegylated하고 EGFR 특이적 펩타이드를 표면에 접합합니다.

그런 다음 나노 입자를 관심 세포에 적용하고 형광에 의한 단백질 발현 분석이 가능하도록 배양합니다. 현미경 검사는 transfection 후 48시간 이내에 전달된 나노 입자 플라스미드의 효율적인 발현을 보여줍니다. ca 벡터를 사용한 유전 물질 전달과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 젤라틴 나노 입자가 세포 독성이 훨씬 적다는 것입니다.

이 기술의 의미는 암 치료로 확장되지만, 암세포에서 과발현된 수용체를 선전하는 것은 유전 물질을 표적 세포에 전달하기 쉽습니다. 이를 통해 플라스미드 전달에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 srna 및 microRNA와 같은 다른 시스템에서도 사용할 수 있습니다.

폴레이트 젤라틴을 생성하여 이 절차를 시작합니다. 먼저 젤라틴 1g을 탈이온수 100ml에 녹이고 실온에서 20mg의 2가지 면역 염산염으로 15시간 동안 배양합니다. 다음으로, 무반응성 시약을 제거하려면 용액을 투석 백으로 옮기고 1리터의 5밀리몰 염산 용액에 담그십시오.

3시간 후, 백을 1리터의 신선한 5밀리몰 염산으로 옮깁니다. 그런 다음 다시 3시간 후에 투석 후 3시간 동안 백을 1리터의 1밀리몰 염산으로 옮깁니다. 용액을 4개의 50ml 원추형 튜브로 옮기고 얼면 섭씨 영하 80도에 놓습니다.

동결 건조기에 이틀 동안 넣으십시오. 다음 단계에 필요할 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 나노 입자를 함유하는 DNA를 제조하는 것은 이것의 가장 어려운 측면입니다.

이 입자의 다음 몇 단계를 따르는 것이 성공하도록 하려면 pH를 적절하게 조정해야 합니다. ethno를 추가할 때 표시하는 것과 같이 정확하게 수행해야 합니다. 나노 입자를 함유 한 DNA를 준비하려면 200 밀리그램의 폴 레이트, 젤라틴 및 물을 용해시킵니다.

0.2몰 수산화나트륨을 첨가하여 용액의 pH를 7로 조정합니다. 그런 다음 EGFP 1 밀리그램과 플라스미드 DNA 1 개를 넣고 용액에 교반 막대를 부드럽게 첨가하고 용액을 고속으로 교반하면서 혼합물에 냉각 에탄올을 천천히 첨가한다. 조성물이 75% 하이드로 알코올 용액에 도달하면 나노 입자가 형성되고 용액이 불투명해집니다.

나노 입자를 더욱 안정화시키기 위해 0.1 밀리리터의 8 % 글리 옥살 용액을 천천히 첨가하여 나노 입자의 아미노 그룹을 가교시킵니다. 그런 다음 무반응성 시약을 담금질하려면 0.5ml의 0.2몰 글리신을 첨가합니다. 용액을 초원심분리기 튜브로 옮기고 16, 000RPM으로 30분 동안 회전합니다.

탈수 후 펠릿을 탈이온수로 두 번 부드럽게 헹굽니다. 즉시 진행하지 않는 경우 샘플을 이전과 같이 동결 건조하고 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 다음으로 나노 입자의 표면을 수정하기 위해 펠릿을 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 0.1몰 인산염 완충액에 재현탁시킵니다.

그런 다음 mal peg SCM의 2 배 무게를 추가하고 천천히 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 배양합니다. 16, 000 분당 회전수에 배양 원심 분리기 후에 pegylated nanoparticles를 모으기 위하여 분. 그런 다음 펠릿을 탈이온수로 두 번 씻으십시오.

나노 입자를 동결 건조하고 섭씨 4도에서 보관하고 EG SCM 변형 나노 입자를 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 0.1몰 인산염 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 10% 중량의 EGFR 특정 펩타이드로 실온에서 6시간 동안 배양하고 6시간 후에 천천히 교반합니다. 펩타이드 변성 나노입자를 16, 000RPM에서 30분 동안 초원심분리하여 수집합니다.

그런 다음 펠릿을 두 번 세척하고 동결 건조하여 정제 된 나노 입자를 섭씨 4도에서 보관합니다. EGFR 표적 나노 입자는 함께 작성된 문서에 설명된 대로 주사 전자 현미경, 화학 분석을 위한 전기 분광법, 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅으로 특성화되어야 합니다. 나노 입자의 특성을 분석한 후에는 transfection 효율을 평가해야 합니다.

이 예시에 사용된 플라스미드는 형광 단백질을 인코딩하므로 형광 현미경으로 transfection 효율을 평가할 수 있습니다. 비형광 단백질의 발현은 웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 엘리자(Eliza)와 같은 다른 방법으로 평가해야 합니다. 먼저, DMEM의 2밀리리터 2밀리리터, P-E-G-F-P-N 1개의 플라즈마 나노입자를 팬이 포함된 6개의 웰 플레이트 각각에 추가합니다.

양성 대조군으로 유리 덮개 슬립에서 자란 한 세포는 20마이크로그램의 플라스미드와 20마이크로리터의 오닉 지질 형질주입 시약인 리포펙션을 결합하여 세포에 첨가했습니다. 처리되지 않은 세포를 포함하는 웰이 음성 대조군으로 사용됩니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 6시간 동안 배양합니다.

그런 다음 transfection 배지를 배양 배지로 교체하고 추가로 24, 48, 72 또는 96시간 동안 배양합니다. 배양 후 배지를 후크 1밀리리터당 1마이크로그램, 3, 3, 3, 4, 2를 포함하는 배양 배지로 교체하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 현미경 슬라이드의 커버 슬립을 장착한 후 차등 간섭, 대비 및 형광 현미경 검사로 세포 내 EGFP의 발현을 평가합니다.

transfection된 세포는 transfection 48시간 후 pan one 세포의 이 이미지에서 볼 수 있듯이 녹색으로 나타납니다. 파란색은 핵의 갈고리 염색을 나타냅니다. 그런 다음 Eliza가 결과를 확인해야 합니다.

transfection 효율이 결정되면 나노 입자를 사용하여 치료용 플라스미드를 전달할 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 대로 야생형 P 53 플라스미드를 함유하는 나노 입자를 생성했으며, 치료 효율을 결정하기 위해 역전사효소 PCR에 의해 형질주입을 검증했습니다. transfection된 pan one 세포를 transfection 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 후에 염색하여 proa 활성을 평가했습니다.

그런 다음 여기에서 볼 수 있는 ISYS 이미징 세포분석기를 사용하여 발현을 분석했습니다. EGFR 표적 처리된 세포는 젤라틴을 위반했습니다. 나노 입자는 가장 많은 양의 자가사멸 활성을 가졌습니다.

이러한 결과는 표적 시스템인 sh gel peg 펩타이드가 가장 높은 transfection 효율을 가지며 apoptosis 및 췌장암 세포를 성공적으로 유도할 수 있음을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 플라스미드 전달을 위해 표적 제트 유전자 입자를 합성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. glaso 또는 기타 교차 연결제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

공연하는 동안 실험실 가운과 장갑을 항상 착용해야 합니다. 이 p.