형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지 현장에서 하이브리드화 (물고기)

이 절차의 전반적인 목표는 세포 내 C 2에서 바이러스 RNA의 위치를 시각화하는 것입니다. 이를 먼저 수행하려면 유리 커버 슬립에서 transfection되거나 감염될 세포를 성장시킵니다. 두 번째 단계는 성공적인 형질주입 또는 감염 후 4%의 파라폼 알데히드로 세포를 고정하는 것입니다.

다음으로, RNA를 표지하는 혼성화 혼합물로 세포를 배양합니다. 이것은 슬라이드 상의 혼성화 혼합물 위에 커버 슬립 셀 면이 아래를 향하게 놓음으로써 수행됩니다. 이 절차의 마지막 단계는 항체를 사용하여 RNA 표지를 위해 세포를 염색하는 것입니다.

궁극적으로, 세포 내에서 표지된 RNA의 국소화는 C 2 혼성화 또는 물고기의 형광에 의해 시각화됩니다. RNA 이미징 및 태그를 사용하는 생명 세포와 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 변형된 RNA와 반대로 네이티브 RNA를 검출할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 환자를 돌보고 커버 슬립을 처리하고, 방법을 표준화하고, 정확한 타이밍을 필요로 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

배양 중 고정을 위해 세포를 배양하는 구체적인 절차는 세포의 유형에 따라 다릅니다. 부착 세포의 경우, 처음에는 처리되지 않은 멸균 유리 커버 슬립에 파종하는 것이 중요합니다. 따라서 수확 시 최종 cofluency는 약 70-80%입니다.Non adloyent cell은 수집할 준비가 될 때까지 표준 방식으로 배양해야 합니다.

그런 다음 감염 또는 형질주입 24시간 전에 일반적인 12웰 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 플레이트 150, 000개의 세포에 대해 폴리 L 라이신으로 처리된 커버 슬립으로 배양합니다. 커버 립의 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 세포 고정 절차를 시작합니다. 조심스럽게 흡인하여 미디어를 버리고 준비된 XPBS 1개와 이중 증류수를 부드럽게 첨가합니다.

또는 DPBS는 1분 동안 세포를 세척합니다. Dathyl pyro CARBATE 또는 DEPC 처리된 XPBS도 사용할 수 있습니다. R nase 효소를 포함할 수 있으므로 처리되지 않은 PBS를 사용하지 마십시오.

DPBS를 버리고 부드럽게 충분히 첨가하십시오.4 % 파라 포름 알데히드를 세포를 완전히 덮고 15-20 분 동안 배양 한 후 파라 알데히드를 버리고 1 분 동안 DPBS로 세포를 씻습니다. DPBS를 버리고 0.1몰 글리신을 10분 동안 배양합니다.

다음으로, 글리신을 버리고 1분 동안 DPBS로 세포를 씻습니다. DPBS를 버린 후 0.2%Triton X 100을 첨가하고 5-10분 동안 배양합니다. 뉴클레올라 또는 핵 외피 단백질을 염색하는 경우 triton X 100을 5분 이상 투과하지 않으면 단백질 국소화가 확산됩니다.

트리톤 X 100을 버리고 물고기에 대한 절차를 시작하기 전에 매번 1분 동안 DPBS에서 두 번 세척합니다. 덮개를 배양 할 측면을 준비하십시오 : 슬립, 잘 청소하고 라벨을 붙이는 데주의를 기울이십시오. 18mm 커버 슬립의 경우 슬라이드에 50마이크로리터의 DNA 용액을 추가합니다.

이 절차의 가장 어려운 부분은 커버 슬립을 적절하게 취급하는 것입니다. 커버 슬립의 오른쪽을 배양하고 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 파손을 방지하기 위해 커버 슬립을 슬라이드에 추가하고 셀 면이 아래로 향하게 놓고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 커버 슬립 판매 면이 위로 향하게 하여 X-D-P-B-S 1개가 있는 배양 접시에 넣습니다.

커버 슬립을 1분 동안 세척하십시오. 이 혼합에는 다음이 포함됩니다. 50% 탈이온화된 형태 아미드, 밀리리터당 1밀리그램, TRNA 2개, X-S-S-P-E, 5개의 X DNAR RNA를 프로브와 DEPC 물을 최종 부피 50마이크로리터까지

이 프로브는 바이러스 게놈 RNA를 상보하도록 설계된 dig genin 표지 RNA 프로브입니다. 장소. 각 덮개는 슬라이드의 혼성화 혼합물 위에서 세포면을 아래로 미끄러뜨립니다. 배양은 50% FIDE 2개의 X-S-S-P-E가 들어있는 트레이에서 수행되어야 합니다.

섭씨 42도에서 16-18시간 동안 배양합니다. 다음으로 섭씨 42도에서 50분 동안 50%fide의 50마이크로리터에서 커버 슬립 셀 면을 아래로 향하게 하여 배양합니다. 섭씨 42도에서 각각 5분 동안 2개의 X-S-S-P-E를 50마이크로리터에 거꾸로 배양하여 두 개의 X-S-S-P-E로 커버 슬립을 두 번 세척합니다.

마지막으로 커버 슬립을 X-D-P-P-S 1개로 1분 동안 세척합니다. 이 절차를 시작하려면, 차단이 완료되면 실온에서 30분 동안 하나의 X Roche 차단 용액 50마이크로리터에 셀 면을 아래로 놓고 실험을 위한 모든 1차 항체를 포함하는 50마이크로리터의 1차 항체 용액에 각 커버 슬립 셀 면을 아래로 향하게 놓아 커버 슬립을 차단합니다. 한 시간 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

DPPS가 들어있는 배양 접시에 커버 슬립 셀 면이 위로 향하게 놓고 10분 동안 커버 슬립을 세척합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 2차 항체 용액을 각 커버 슬립의 슬라이드에 피펫팅합니다. Alexa floor conjugated antibody는 다양한 색상을 생성하는 데 사용할 수 있으며 하나의 x 차단 용액과 하나의 X-D-P-B-S에 1에서 500까지 희석하여 사용되며, 각 커버 슬립 세포의 면이 아래로 향하게 하여 2차 항체 용액에 넣고 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

커버 슬립을 각각 10분씩 두 번 세탁하십시오. DPBS 건조에서는 덮개가 압지 조각에서 셀 쪽을 위로 밀어 넣습니다. 빛과 표백에 노출되지 않도록 커버 슬립을 반드시 덮으십시오.

모든 액체가 증발하면 덮개 슬립을 새 슬라이드에 장착합니다. 8마이크로리터의 면역 마운트를 사용하여 커버 슬립을 부드럽게 두드려 기포를 제거하고 커버 슬립 가장자리에 매니큐어를 바르면 제자리에 고정됩니다. 현미경 검사 기술에 의한 RNA 및 단백질의 시각화도 이 절차의 성공에 매우 중요합니다.

사용된 현미경의 설정은 시각화에 도움이 될 수도 있고 방해가 될 수도 있습니다. 따라서 현미경의 설정을 올바르게 설정하고 주어진 실험에서 한 샘플에서 다른 샘플로 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. 물고기에 의한 바이러스 RNA 시각화와 면역형광에 의한 단백질 국소화의 대표적인 결과가 이 그림에 설명되어 있습니다.

헬라 세포가 HIV 1로 형질 주입되는 이 첫 번째 패널에서, 녹색으로 유도된 HIV 1에 대한 바이러스 RNA는 대부분 확산적으로 표시된 세포질 전체에서 볼 수 있으며, 작은 세포질 펀트가 드문 것은 아니지만, 바이러스 RNA 염색만 나타내는 흑백 삽입 이미지에서 볼 수 있듯이 형광을 나타내지 않는 주변 세포와 양성 세포를 비교하여 특이성을 확인할 수 있습니다. 붉은 염색은 Ross GA PSH 3 도메인 결합 단백질 또는 G 3 bp의 면역 형광을 반영하며, 이는 주로 helo cell이 regulatory rev protein이 결핍된 HIV 1과 형질 주입 될 때 세포질을 표시합니다. 생성된 바이러스 RNA는 핵에 남아 있습니다.

이는 핵의 밝은 녹색 신호와 세포질의 RNA 형광 신호 부족으로 시각화할 수 있습니다. HIV one 바이러스 RNA의 분포는 특정 세포 단백질의 과발현에 의해서도 변경될 수 있습니다. 예를 들어, RAB 7 상호 작용 리소좀 단백질 또는 엔도솜 소포 이동에 관여하는 실제 A 단백질의 과발현은 녹색으로 추적된 바이러스 게놈 RNA를 마이크로 세뇨관 조직 센터로 재국소화합니다.

여기서 엔도솜은 램프 1에 의해 태그가 지정되고 빨간색으로 염색됩니다. 대조적으로, 다인 모터 복합체에 접착된 P one 50에 결합할 수 없는 아미노 말단 결실 델타 N의 과발현은 P 50 dyin의 발현을 통해 세포질 내의 후기 엔도솜을 분산시켜 Dine Motor의 큰 소단위체를 차단하고 후기 엔도솜을 방출할 뿐만 아니라 바이러스 게놈 RNA 및 HIV V 1 구조 단백질을 세포 주변부로 방출합니다. HIV 1이 헬로 세포에서 발현된 후 다른 시점에서 세포를 채취 및 분석하면 바이러스 RNA는 형질주입 및 감염 후 3시간 이내에 세포에 나타나며 12시간까지 이 물고기 기술로 쉽게 관찰할 수 있게 됩니다.

여기서 바이러스 RNA 발현은 녹색으로 추적되고 세포 단백질 H-N-R-N-P-A 1은 빨간색으로 염색됩니다.이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 첫째 날에는 20분, 둘째 날에는 4시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 커버 슬립을 섬세하게 다루어 파손되지 않도록 하고 2차 항체가 적용된 후에는 빛을 피하는 것이 중요합니다. HIV V 1 및 기타 높은 수준의 병원체로 작업할 때 고정하기 전에 매우 위험하므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 교육 및 봉쇄와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.