Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 곰팡이 병원균인 Candida albicans를 사용하여 제브라피시 유충을 감염시키는 기술을 시연하는 것입니다. 먼저, 형광 곰팡이 배양을 준비하고 물고기 배아를 코팅합니다. 다음으로, 물고기는 아로스 주입 접시에 줄 지어 있습니다.

칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 각 물고기의 귀를 통해 뒷뇌실 낚시꾼에게 마이크로 주입한 다음 저융점 에어로에 삽입하고 에피 형광 현미경으로 시각화합니다. 궁극적으로 이 방법은 페트리 접시의 단순화된 시스템이 아닌 숙주의 복잡한 환경에서 숙주 병원체 상호 작용을 비침습적으로 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다. 유아 정맥 주사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 치명적인 전파 질환을 초래하는 국소 감염을 일으킨다는 것입니다.

또한, 이 기술은 본질적으로 큰 C 부칸 세포를 작은 제브라피시 유충에 효율적으로 주입할 수 있습니다. 효모 폰에 칸디다 알비칸 스톡을 줄무늬로 만드는 것으로 시작합니다. 포도당 한천 플레이트는 군체가 자랄 수 있도록 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

군체가 보이면 멸균 나무 은못을 사용하여 고립된 군체를 선택하고 16 x 150mm 배양 튜브에 5ml의 신선한 효모 추출물 펩토 포도당 육수에 효모를 용해시킵니다. 시험관 휠과 인큐베이터가 장착된 조직 배양 롤러 드럼에 배양물을 섭씨 37도에서 밤새 놓습니다. 다음날, 1.5 밀리리터에 문화의 1 밀리리터를 옮기십시오 관을 떨어져 끝내고 14, 000 시간, 세포를 펠릿으로 만들기 위하여 1 분 동안 G에 그것을 원심 분리하십시오 그 후에 supinate를 버리고 그것을 풀기 위하여 펠릿 와동을 치십시오.

1밀리리터의 PBS 와류에 세포를 재현탁시키고 다시 원심분리합니다. 그런 다음 supinate를 버리고이 세척을 반복하십시오. 잔류 배양 배지를 제거하기 위해 세 번 단계를 수행합니다.

세포가 세척되면 PBS에서 1-100 희석으로 혈구 분석기에서 세포를 계수합니다. 12시간 배양의 경우 밀리리터당 8개의 세포에서 10의 3-4배를 예상해야 합니다. Reese's는 최종 농도 10에서 밀리리터당 7개의 세포로 효모를 구부립니다.

주사 전날 체를 사용하여 산란 수조에서 얼룩말 물고기 배아를 채취하고 멸균 탈이온수에 1밀리리터당 60mg의 인스턴트 해염이 함유된 난수 용액에 보관합니다. 그런 다음 배아를 33도 SIU에서 12시간 라이트 다크 사이클로 24시간 동안 배치합니다. 이를 통해 배아가 감염 당일 감염을 위한 최적의 단계인 prim 25 유충 단계로 발달할 수 있습니다.

60ml의 달걀수에 피펫을 넣어 배아를 매우 깊은 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 사용자는 현미경과 dumont 핀셋을 해부하여 배아를 코팅합니다. 이것은 생선이 튀어나올 때까지 코리안을 감자 칩 봉지처럼 부드럽게 잡아당겨 얻을 수 있습니다.

모든 배아가 dec 코팅되면 따라서 페트리 접시가 물고기를 중앙으로 옮기는 동안 생선을 접시 뚜껑으로 옮기고 매체를 제거한 다음 신선한 계란 물로 교체하십시오. 신선한 달걀 물에 생선을 넣으십시오.

트랜스퍼 피펫을 사용하여 물고기를 마취하기 위해 밀리리터당 200마이크로그램의 트리카 메탄 설포네이트 용액을 준비합니다. 20-50개의 배아를 모아 1-2분 동안 또는 움직임을 멈출 때까지 마취액에 넣으십시오. 그 동안 주입 장치를 켜고 압력이 펄스로 전환되고 펄스 지속 시간이 배압 장치에 대해 3PSI로 9로 설정되어 있는지 확인합니다.

주입 압력이 30PSI에 도달할 때까지 질소 탱크의 밸브를 점차적으로 엽니다. 다음으로, 풀링된 마이크로 피펫에 5마이크로리터의 와류 칸디다 알비칸 용액을 넣고 마이크로 피펫 홀더에 넣습니다. 물이 들어 있는 매우 깊은 페트리 접시를 해부 현미경 s에 놓습니다.tage 그리고 그것이 view그리고 그 끝이 물에 부분적으로만 잠길 때까지 마이크로피펫 위치를 조정합니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 팁에서 약 3mm 떨어진 곳에 모인 피펫의 바늘을 자릅니다. 바늘이 성공적으로 잘린 경우 주입 장치의 풋 스위치를 누르면 액체를 분배할 수 있습니다. 눈금이 매겨진 슬라이드를 사용하여 분배된 부피를 측정한 다음 분배되는 액체의 부피가 직경이 0.21mm 또는 얼룩말 물고기 배아의 동공 크기보다 약간 작도록 압력을 조정합니다.

현미경을 설정하고 물고기를 마취한 후 접시를 부풀어 물고기를 중앙으로 끌어당기고 전사 피펫으로 가져갑니다. 생선이 끝에 가라앉도록 피펫의 측면을 조심스럽게 두드립니다. 그런 다음 가능한 한 적은 부피를 사용하여 섭씨 28도로 예열된 애벌레 아오스 주입 접시에 물고기를 부드럽게 놓습니다.

부드러운 유리 막대를 사용하여 물고기를 조심스럽게 정렬합니다. 그런 다음 종이 타월로 접시에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 바늘과 첫 번째 물고기가 모두 명확하게 보일 때까지 물고기가 있는 aros 접시를 현미경 아래에 놓습니다.

눈에 보이는 심장 박동의 존재를 관찰하여 각 물고기가 아직 살아 있는지 확인하십시오. 죽었다면 버리고 다음 것으로 넘어갑니다. 확대하는 물고기 쪽으로 유리 바늘을 움직입니다.

그렇게 하면서 눈 바로 뒤에 두 개의 귀돌이 있는 물고기의 귀 원형 구조에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다. 바늘이 제자리에 고정되면 풋 스위치를 사용하여 효모를 주입합니다. 바늘이 올바르게 삽입되면 물고기는 주사 후 뇌실이 약간 휘어지고, 바늘을 집어넣고 다음 물고기로 절차를 반복합니다.

전체 과정은 15분 또는 20분 이상 걸리지 않아야 하며 이 시간이 지나면 물고기가 마르고 죽습니다. 효모는 또한 마이크로 파이펫의 바닥에 침전되어 고인 마이크로 파이펫의 불균일한 감염, 용량 및/또는 막힘을 유발할 수 있습니다. 모든 생선을 주입한 후 달걀 물을 사용하여 아로스에서 씻어내고 60ml의 달걀 물이 들어 있는 신선한 페트리 접시에 넣습니다.

그런 다음 접시를 섭씨 28도에 놓습니다. 질소 밸브를 닫고 주입 스위치를 연속으로 설정하여 탱크 라인의 압력을 완화합니다. 그런 다음 압력이 0으로 떨어지면 스위치를 다시 pulse로 설정하고 주입 장치를 끕니다.

앞서 설명한 대로 트리카 메탄 설페이트에 감염된 물고기를 마취시키는 것으로 시작합니다. 물고기가 마취되면 피펫을 사용하여 한 번에 한 마리의 물고기를 0.4%의 낮은 용융 한천이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 전사 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 아그로스를 운반합니다.

페트리 접시의 각 물고기를 약 0.2 밀리리터의 유리 바닥 이미징 접시의 한 우로 옮기고 0.4 % 낮은 용융이 발생하며 물고기 위에 밀리리터 당 200 마이크로 그램의 마취제가 보충되어 내부 원이 채워지고 우물 바닥을 가로 질러 얇은 아로스 층이 퍼집니다. 이제 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템이 있는 도립 현미경을 사용하여 최대 24시간 동안 물고기를 이미지화할 수 있습니다. 얼룩말 물고기를 붉은 형광 칸디다 알비칸스에 감염시킨 지 5시간 후.

효모는 FL I EGFP 물고기와 같은 물고기의 뒷뇌에서 볼 수 있으며, 물고기의 몸 전체에 걸쳐 세포와 같은 혈관 내피 및 대식 세포는 형광성입니다. 감염 후 5시간이 지나면 녹색으로 표시됩니다. 효모는 세포와 같은 대식세포 내에서 24시간까지 볼 수 있습니다.

감염은 등쪽 꼬리 조직을 따라 퍼졌으며 효모는 FTIC 세포 내에서 다시 검출될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 곰팡이 배양을 준비하는 제브라피시 유충 1마리와 마취 제브라피시 유충 2마리를 포함하여 Prim 25단계 제브라피쉬의 후뇌실에 칸디다 알비칸스를 미세 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 후뇌심실에 3개의 마이크로 주입.

그리고 넷째, 컨포칼 이미징을 위해 감염된 유충을 준비합니다.