형광성의 현장에서 하이브리드

이 절차의 전반적인 목표는 모기 게놈의 염색체 매핑을 위한 간단한 기술을 개발하는 것입니다. 이것은 먼저 네 번째 instar 모기 유충의 가상 디스크를 사용하여 고품질 염색체 확산을 얻음으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 프로브의 비특이적 혼성화를 차단하기 위해 형광 표지된 DNA 프로브와 표지되지 않은 반복 DNA 분획을 준비하는 것입니다.

세 번째 단계는 형광 표지된 DNA 프로브를 염색체에 혼성화하는 것입니다. 마지막 단계는 형광 현미경을 사용하여 프로브의 염색체 위치를 감지하는 것입니다. 세포주나 뇌신경절에 대해 상상의 디스크를 사용하는 것의 장점은 표준 프로토콜을 사용하여 별모기의 힘으로 많은 수의 띠 모양의 퍼질 수 있는 염색체를 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다.

모기 알은 2-3일 이동 후 섭씨 28도에서 부화하고, 두 번째 또는 세 번째 인스타 유충은 종에 따라 섭씨 16도 또는 섭씨 22도의 인큐베이터에서 부화합니다. instar 개발 단계는 헤드 캡슐 크기를 기준으로 합니다. 네 번째 instar를 사용할 수 있게 되면 얼음 위에서 고정시킨 다음 차가운 저장성 용액 한 방울이 있는 슬라이드로 유충을 옮깁니다.

실체 현미경으로 추가 해부를 위해 타원형 모양의 상상 디스크가 있는 유충을 선택합니다. 상상 디스크라는 용어는 ID로 축약됩니다. 타원형 모양의 상상 디스크를 가진 모기 유충의 올바른 단계를 선택하는 것은 고품질 염색체 확산을 얻는 데 매우 중요합니다.

해부 가위를 사용하여 유충의 목을 자르고 rax의 복부 쪽에서 큐티클을 자릅니다. 장을 절개하기 위해 두 번째 또는 세 번째 복부를 추가로 절개합니다. 이제 큐티클을 열고 유충에서 장과 지방을 제거합니다.

여과지를 사용하여 슬라이드에서 저장성 용액을 흡수합니다. 용액을 ID 바로 위에 놓인 새로운 저장성 용액 한 방울로 교체하십시오. 유충을 저장성 용액에 10분 동안 보관합니다.

그런 다음 여과지를 사용하여 용액을 제거하고 자동차 소음 용액을 도포하십시오. ID는 즉시 흰색으로 변하고 현미경으로 쉽게 볼 수 있습니다. 해부 바늘을 사용하여 유충에서 ID를 제거합니다.

50%프로폰산 한 방울을 추가한 다음 커버 슬립으로 ID를 덮고 10분 더 기다렸다가 계속 진행합니다. 이제 슬라이드를 여과지로 덮고 커버 슬립에 있는 연필 지우개를 세게 두드려 티슈를 짓누릅니다. 위상차 현미경을 사용하여 100배 또는 200배 배율로 슬라이드의 품질을 간략하게 분석합니다.

염색체 스프레드가 50개 이상인 제제는 물고기에 적합한 것으로 간주될 수 있습니다. 이제 거품이 멈출 때까지 슬라이드를 액체 질소에 담그고 유지합니다. 면도날을 사용하여 슬라이드에서 커버 슬립을 제거하고 슬라이드를 섭씨 영하 70도에서 냉각된 20% 에탄올 용기에 즉시 옮깁니다.

탈수를 위해 다음 단계로 진행하기 전에 70% 에탄올의 차가운 슬라이드를 수집합니다. 다음으로, 수조당 5분 동안 일련의 에탄올로 슬라이드를 추가로 탈수하고 건조되면 슬라이드를 실온에서 자연 건조시킵니다. 물고기가 게놈 및 백 클론 DNA를 추출하기 전에 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 보관하고 관심 모기 종의 반복 DNA 분획을 준비하여 NIC 번역 및 PCR을 사용하여 I-G-S-R-D-N-A를 사용하여 프로브 라벨 백 클론 DNA를 준비합니다.

이 두 프로브에 대한 절차는 백 클론이 있는 물고기의 경우 약간 다릅니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 두 개의 XSSC에서 ID 슬라이드를 배양하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 슬라이드를 염산에 Pepin 용액이 든 병에 옮기고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

Pepin 목욕 후 PBS의 포르말린이 든 병에 넣기 전에 하나의 XPBS에서 슬라이드를 5분 동안 씻습니다. 염색체를 실온에서 10분 동안 고정합니다. XPBS 1개로 포르말린을 5분 동안 씻어낸 다음 이전과 동일한 에탄올 시리즈를 사용하여 슬라이드를 탈수합니다.

준비를 공기 건조하여 마무리합니다. 지금 prewarm, 70%form 아미드를 가진 단지에 있는 활주를 72 섭씨 온도에 2 분 동안 변성시키십시오. 그런 다음 에탄올 시리즈로 슬라이드를 탈수한 다음 섭씨 37도에서 공기 건조합니다.

이 시점에서 물고기 교잡 혼합물을 준비합니다. 이제 0.1 부피의 3 몰 아세트산 나트륨과 2 부피의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. 믹스를 섭씨 영하 20도에서 1-3시간 동안 유지하십시오.

다음으로, 침전된 DNA를 원심분리하여 에탄올과 공기를 흡인합니다. 펠릿을 실온에서 2-3분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 DNA 펠릿을 10 마이크로 리터의 혼성화에 완전히 용해시킵니다. 완충기.

혼성화 혼합물을 섭씨 97도에서 7분 동안 변성시킵니다. 그런 다음 즉시 얼음 위에 1분 동안 놓습니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 사전 혼성화합니다.

표지되지 않은 반복적인 DNA 분획을 가진 DNA 프로브의 사전 혼성화는 염색체에 대한 프로브의 비특이적 혼성화를 방지하는 데 필수적입니다. 혼성화 혼합물 10마이크로리터를 슬라이드에 놓고 조심스럽게 덮습니다. 커버 슬립에 부드러운 압력으로 우발적인 기포를 제거하고 고무 시멘트를 사용하여 커버 슬립을 주변으로 밀봉합니다.

그런 다음 슬라이드를 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 다음날 슬라이드에서 고무 시멘트와 커버 슬립을 제거합니다. 섭씨 73도의 예열 용액에서 1분 동안 슬라이드를 세척한 다음 실온에서 2분 동안 용액 2에서 5분 동안 세척합니다.

실온의 어두운 챔버에서 요요 원으로 슬라이드를 반염색합니다. 마지막으로, 커버 슬립을 사용하여 소량의 연장된 금 Antifa 시약에 염색체를 장착하고 I-G-S-R-D-N-A 프로브로 물고기에 대한 준비를 분석합니다. RNA 용액으로 염색체 제제를 전처리합니다.

반복적인 DNA 분획을 추가하면서 염색체 준비와 프로브를 동시에 변성시키지 마십시오. Fish는 백 클론 DNA 프로브를 사용하여 80 년대 이집트의 유사 분열 염색체에서 수행되었습니다. 염색체는 요요 요오드화물로 대조 염색됩니다.

비교를 위해. 백 클론 DNA 프로브를 사용하는 물고기는 olx Quinco Fasciatus의 유사 분열 염색체에서도 수행되었습니다. 마지막으로 I-G-S-R-D-N을 사용하여 낚시를 합니다.

변칙의 유사 분열 염색체에 대한 프로브가 수행되었으며, 개발 후 갬 비어가 수행되었습니다. 이 기술은 학문 분야의 연구자들이 염색체를 탐구하고 다양한 종의 모기 및 기타 곤충에서 게놈 매핑을 수행할 수 있는 길을 열었습니다.