전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

이 절차의 전반적인 목표는 공학적 근육 조직을 생성하는 것입니다. 이는 필요한 수의 세포를 얻기 위해 먼저 위성 세포 또는 근아세포 세포주를 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 앵커링 지점을 만드는 것입니다.

다음으로, 세포를 겔과 혼합하고 생성된 혼합물을 앵커링 포인트 사이에 주조합니다. 마지막 단계는 세포를 근육 조직으로 분화하는 것입니다. 궁극적으로, 전기 자극을 사용하여 세포의 수축을 유도할 수 있으며, 형광 염색 및 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 분화된 근육 세포에서 세포골격의 육종 조직을 검출할 수 있습니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 근육 세포가 이러한 조직에서 한 방향으로 정렬된다는 것입니다. 이 기술은 근육 손실로 고통받는 환자에게도 영향을 미칩니다. 예를 들어, 미래에 환자 자신의 세포를 사용하여 이러한 조직을 만든다면 이식 목적으로 사용할 수 있습니다.

이 방법은 근육 및 근육 손상의 발달에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 재생 의학 및 체외 배양육과 같은 새로운 응용 분야에 대한 통찰력도 제공합니다. 이 절차를 시연하는 것은 미림을 분리하고 동결하는 아리안 방법(arian Methods for isolate and freezing mirin)입니다. Myoblast 전구 세포는 다른 곳에서 설명되었습니다.

전체 참조를 위해 서면 프로토콜을 참조하십시오. 액체 질소에서 마우스 근아세포 전구 세포의 바이알을 회수한 후. 바이알을 섭씨 37도의 수조에 넣어 해동합니다.

그런 다음 10ml의 가온 성장 배지를 25cm 제곱의 마트릭 젤 코팅 조직 배양 플라스크에 추가합니다. 세포가 해동되는 즉시 바이알의 내용물을 미디어에 추가합니다. 조직 배양 플라스크에서 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다.

배양 3일차에 트립신(trypsin), 화(ization) 및 원심분리(centrifugation)로 세포를 수확합니다. 1000RPM에서 세포를 75cm 메이저 겔 코팅 조직 배양 플라스크로 통과시키고 3일마다 세포를 분할하고 6일째에 세포를 150cm 제곱의 마트리 겔 코팅 조직 배양 플라스크에 통과시킵니다. 9일차에 150cm 제곱의 마트리 겔 코팅된 조직 배양 플라스크에서 세포를 150cm 제곱의 마트리 겔 코팅된 조직 배양 플라스크 3개 또는 150cm 제곱 플라스크 3개로 옮깁니다.

배양 12일째가 되면 세포는 근육 구조체로 파종할 준비가 됩니다. 이 회로도에 표시된 것처럼 삼각형 모양의 한쪽 모서리가 있는 약 5mm 정사각형의 벨크로 세그먼트를 절단하는 것으로 시작하고 벨크로의 부드러운 면만 사용합니다. 그런 다음 엘라스토머와 경화제를 10 대 1 비율로 혼합하여 실리콘 접착제를 준비합니다.

그런 다음 6 개의 우물 배양 플레이트의 각 우물에 벨크로 2 개를 붙이고 조각 사이에 약 12mm를 남겨두고 밤새 말리십시오. 다음날, 우물에 70% 에탄올을 첨가하고 15분 동안 배양하여 우물과 벨크로를 살균합니다. 그런 다음 PBS로 우물을 세 번 헹굽니다.

세 번째 세척은 우물에 그대로 두고 플레이트를 15분 동안 자외선에 노출시킵니다. 그런 다음 PBS를 흡인하고 사용할 준비가 될 때까지 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 밀리리터당 3.2밀리그램, 콜라겐 및 멸균 0.02% 아세트산의 용액을 준비합니다.

콜라겐 용액을 얼음 위에 올려 냉장고에서 이전에 해동한 마트리겔 용액과 함께 놓습니다. 다음으로, 트립신(trypsin), 화(ization) 및 원심분리(centrifugation)에 의해 세포를 수확합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 성장 배지에 재현탁시키고 표준 절차에 따라 세포 계수를 수행합니다.

세포 계수가 완료되면 세포가 들어 있는 튜브를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 매트릭스 용액은 51.3% 콜라겐 용액 0.2%0.5 몰 수산화나트륨, 8.6% 매트릭스 겔 및 39.9% 성장의 비율로 얼음에 용액을 혼합하여 제조됩니다. 보통. pH가 증가하면 급격한 생성이 발생할 수 있으므로 최종 용액이 분홍색인지 확인하십시오.

최종 부피는 도금할 웰의 수에 따라 다릅니다. 이 표는 10개 근육의 부피를 보여줍니다. 세포가 완전히 재현탁되었는지 확인하고 구조체당 750, 000 - 1, 250, 000 세포를 5분 동안 1000RPM의 새로운 원심분리기 튜브 원심분리기로 옮기고, 상등액을 흡입하고 세포 펠릿을 작지만 충분한 부피의 매트릭스 혼합물에 재현탁합니다.

그런 다음 펠릿이 완전히 재현탁되면 매트릭스 혼합물의 나머지 부피에 세포를 추가합니다. 이제 인큐베이터 파이프에서 0.35-0.4 밀리리터의 세포 매트릭스 혼합물을 각 벨크로 조각으로 예열 플레이트를 회수 한 후. 그런 다음 부착 부위 사이의 중앙에서 혼합물을 파이프로 연결하기 시작하고 벨크로까지 확장하십시오.

마지막으로, 젤의 나머지 부분을 사용하여 두 개의 벨크로 앵커와 벨크로 조각 주위의 피펫 사이의 틈을 채웁니다. 접시를 덮고 5-10분 동안 실온에 두십시오. 그런 다음 접시를 부드럽게 두드리고 젤이 단단한지 육안으로 검사합니다.

이 경우 접시를 조직 배양 인큐베이터로 부드럽게 옮길 수 있습니다. 인큐베이터에서 1-2시간 후, 각 젤에 4ml의 예열 성장 배지를 부드럽게 바르십시오. 그런 다음 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.

24시간 후 성장 배지를 분화 배지로 교체합니다. 2-3일마다 미디어 변경을 반복합니다. 성숙한 지향 근육 섬유는 배양 7일째에 분명해야 합니다.

이 시점에서 섬유는 전기적으로 자극될 수 있습니다. 먼저 이온 광학 플레이트의 전극을 70% 에탄올로 15분 동안 살균하고 자외선 아래에서 30분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 멸균된 전극을 배양 플레이트에 놓고 플레이트의 바닥을 보여주는 이 그림과 같이 전극이 근육 구조체와 평행하게 배치되도록 하고 흰색 화살표는 전극이 플레이트를 뚜껑으로 덮고 조직 배양 인큐베이터로 이동함을 나타냅니다.

이온 광학 C 페이서를 적절한 케이블에 연결하고 여기에 자극 프로토콜을 적용합니다. 센티미터당 4볼트. 2헤르츠의 주파수에서 6개의 밀리초 펄스가 사용됩니다.

전기 자극은 일반적으로 48시간 동안 수행됩니다. 자극 중 24시간마다 배양 배지를 교체하십시오. 이 이미지는 성숙한 근육 구조의 일반적인 예를 보여줍니다.

조직의 크기는 길이 약 8mm, 너비 2mm, 두께 0.5mm입니다. 이 이미지는 조작된 골격근 조직에서 근육 전구 세포의 전형적인 예를 보여줍니다. 자극되지 않은 미러링 생체 인공 근육 또는 M bms의 동결 부분.

분화 8일째에 빨간색으로 표시된 sarcomeric alpha actininin, 녹색으로 표시된 sarcomeric myosin, 파란색으로 표시된 nuclei에 대해 염색되었습니다. 오른쪽의 패널은 상자 영역의 확대입니다. 이 프로토콜은 C, 2, C, 12 셀에서도 사용할 수 있습니다.

이 이미지는 마지막 이미지와 동일한 방식으로 염색된 분화된 C, 2개의 C, 12 세포를 보여줍니다. Sarcomeric alpha actinin은 빨간색으로 표시됩니다. Sarcomeric myosin은 녹색으로, 핵은 파란색으로 표시됩니다.

다시 말하지만, 오른쪽의 패널은 상자 영역의 확대입니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 것을 얼음 위에 두는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 발달 후 유전자 발현 수준의 변화를 입증하기 위해 정량적 PCR과 같은 추가 질문에 답하기 위해 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 연구자들이 조직 형태 형성에서 역학의 역할을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 또한 엔지니어링된 심장 근육 모델의 설계에도 도움이 되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 하이드로겔 기반 골격을 사용하여 엔지니어링된 근육 조직을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.