Name: 전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 학습하세요 마우스 myoblast 전구 세포를 이용한 공학 골격근 조직 제작 방법과 전기 자극을 통한 근육 수축 유도 기술을. 이 기술은 재생의학 및 대체 육류 생산에 활용됩니다.

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저자는 배양 그림 2에 표시되는 조직을위한 Yabin 우 감사 할 사진이 바트 반 Overbeeke로 촬영되었다. 작품은 재정적 SenterNovem, 교부금 ISO 42022에 의해 지원되었다.

1. 손쥐 Myoblast의 전구 세포 또는 C2C12 세포의 문화 <ol><li> 처음 Shefer 및 동료 (10)에 의해 출판하고 나중에 콜린스 외. 11 Boonen 외. 12 적응 프로토콜에 따라 세포를 분리 및 액체 질소에 이것들을 저장합니다. 이 마우스, 예를 들어 C57Bl / 6이 필요합니다. 다른 방법은 예를 들어 리 Y 외하여 시각화 실험의 저널에 출판하는 방법, 다른 실험실에 사용됩니다. 13. 시약 및 장비를 들어 당신은 7 페이지와 8의 표라고합니다. 하나의 마우스에서 근육에서 일반적으로 액체 질소의 약 20 병을 cryopreserve하기에 충분한 세포를 얻을 수 있습니다. 다음, 우리는 액체 질소 저장에서 세포를 해동 할 수있는 프로토콜을 시작합니다. </li><li> 25cm 2 Matrigel (1 MG / ML) 코팅 조직 배양 플라스크에 한 유리 병에서 세포를 놓고 이루어진 성장 매체 (GM) (335 ML DMEM 고급, 100 ML 태아 bovin을 추가전자 혈청 (FBS), 50 ML HS, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML L-glutamin, 5 ML 닭 배아 추출물 (혼)). </li></ol> 참고 : 상온에서 2 시간에 코트 흡인하여 Matrigel을 제거합니다. <ol start="3"><li> 세포는 약 삼일마다 1시 3분 하위 문화. 이 말의 의미는 : 일 3 : 한 75cm 2 플라스크에서 두 150cm 2 플라스크 (코팅 플라스크에 preplating 30 분 포함)에 대한 통로 셀 : 일 6시 75cm 2 플라스크에 한 25cm 2의 항로 세포. 일 9 전송 한 150cm 2 병 세 150cm 2 플라스크 (필요한 경우 preplate가 다시 세포의 표현형에 따라)에 사용할 1 개의 트리플 150cm 2 병, 또는 경우에. 하루에 12에 세포가 근육 구조에 퍼 뜨리고위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 참고 사항 : - 트리플 150cm 2에 따라 세포의 수는 약 4.5 X 10 6 세포 될 것입니다. -로 사용다른 isolations의 재산이 시딩시 세포의 혼합 인구를 얻기 위해 그들을 혼합합니다. 참고 : 기본 셀 작동하지 않을 경우, C2C12 myoblasts는 좋은 대안입니다. 2. 공학 골격근 화장지에게 <ol><li> &quot;경화 대리인&quot;(10시 1분)와 &quot;탄성&quot;을 혼합하여 실리콘 접착제를 준비합니다. 한 삼각면 (; 그림 1 모양 집과 같은)에 벨크로의 5mm 평방 세그먼트 - + / 잘라. 사각형 사이의 약 12​​ mm의 공간에서 6 잘 문화 판의 우물에 접착제 벨크로. </li></ol> 참고 사항 : - 만 벨크로의 부드러운면을 사용하고 측면 위쪽을 향하고 있습니다. - 지붕이 서로 마주 있는지 확인하십시오. - 만 실리콘 접착제와 벨크로를 커버 잘 전역에 접착제를 전염되지 않습니다. - 나중에 전기 자극의 경우는 잘 PL 수직 방향으로 구조를 정렬하는 관련(긴 축을 따라) 먹었다. <ol start="2"><li> 진공 오븐에 하룻밤 건조하게 놔둬, 가열하지, 주로 기포를 제거합니다. 15 분의 우물과 부화 70 % EtOH를 추가하여 살균. PBS로 3 배 씻어 15 분에 UV 아래 넣어. 우물에서 모든 PBS 및 사용까지 보육에 벨크로와 장소를 제거합니다. </li><li> 냉장고에 Matrigel 솔루션을 해동 곧 3D 구조를하기 전에 원하는 농도로 콜라겐 솔루션을 준비합니다. 멸균 0.02 % 아세트산 (최종 농도 3.2 밀리그램 / ML)와 주식 콜라겐을 희석. </li></ol> 참고 : 얼음의 모든 둡니다. <ol start="4"><li> GM과 횟수에 resuspend 세포를 Trypsinize. 보육의 원심 분리기 튜브에 세포를 둡니다. </li><li> 이 콜라겐 솔루션으로 0.5M NaOH를 추가, 당신은 관 (표 1에 따라)에 변경하고자하는 구조의 숫자 콜라겐 주식 솔루션의 원하는 금액을 추가 밝은 분홍색 colo까지R은 7.5의 산도를 나타내는 수 있습니다. 등을 아래로 pipetting하여 부드럽게 섞어서 거품 형성을 피할 수 있습니다. 그런 다음 Matrigel을 추가하고 부드럽게하지만 철저하게 매우 섞는다. 마지막으로, 콜라겐 / Matrigel 혼합물 (해당 금액에 대한 표 1 참조)에 GM을 추가합니다. </li></ol> 참고 사항 : - 얼음의 각 단계를 수행! Matrigel과 콜라겐이 증가하고 온도에서 쉽게 젤 것이다. - 색상이 실제로 분홍색입니다 조심해! 산도의 증가는 빠른 겔화를 유도합니다. - 콜라겐의 최종 농도 : 1.6 MG / ML. <ol start="6"><li> 5 분 1,000 rpm으로 세포의 원하는 금액을 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 제거합니다. </li></ol> 참고 : - 구성 당 세포의 숫자가 조정해야하는 세포의 활동에 따라. 일반적으로 세포의 수는 구조 당 750,000 사이 1,250,000 세포를 자리 잡고 있습니다. <ol start="7"><li> 세포 펠렛을 resuspend하는 겔 혼합물의 일부를 사용하여나머지 혼합물에 세포를 전송하고 철저하게 혼합하지만, 기포를 도입하지 않고. </li><li> 보육 및 피펫 벨크로 첫째로 셀 겔 혼합물의 0.35 -0.4 ML의 preheated 잘 접시를보십시오. 그런 다음 첨부 파일 사이트 사이의 중심에서 혼합물을 피펫과 벨크로로 확장하기 시작합니다. 마지막으로, 벨크로 조각 주위에 두 개의 벨크로 앵커와 피펫 사이의 간격을 채우기 위해 젤의 나머지를 사용합니다. </li><li> 젤은 양도 할 정도로 단단한 경우주의 깊게 5-10 분 후 확인 즉, 부드럽게 요리를 누르고 젤이 단단한 경우 시각적으로 검사한다. 그렇다면, 보육에 요리를주의 깊게 배치합니다. 보통, 그들은는 열명 분 후에 픽업 할 수 있습니다. 그런 다음, 1-2의 시간 후, 부드럽게 따뜻한 GM의 4 ML 각 젤을 입혀 라. </li></ol> 참고 :-DO 접시를 다룰 때 어떤 힘차게 운동을하지. <ol start="10"><li> (성장 매체 차별화 매체에 의해 GM 교체여자의 배아 추출물없이) 24 시간 후, 신선한 중간마다 2~3일로 교체하십시오. 일 7 당신이 융합 된 근육 섬유에서 교차 결 개발에 얼룩으로 평가 될 수 있기 때문에, 성숙 지향적 인 근육 섬유를 얻은 것입니다. </li></ol> 3. 전기 자극 <ol><li> 안전 캐비닛의 UV 이하 70 %의 에탄올과 이후 건조에 사용하기 전에 ionoptix 판에서 전극을 (시약 및 장비의 표를 참조) 소독하다. 구조와 문화 판 위에 전극으로 판을 놓고 문화 판과 보육에 송금 뚜껑을 다룹니다. 적절한 케이블로 Ionoptix C-맥박 조정 장치를 연결합니다. </li></ol> 참고 : 전극은 근육 구조 (그림 2)와 함께 병렬 배치됩니다. <ol start="2"><li> 예상대로 자극 프로토콜을 적용합니다. </li></ol> 참고 : 우리는 일반적으로 4 V / CM을 사용하여2Hz의 주파수에서 6ms 펄스. 문화 매체에게 자극 동안은 24 시간을 변경합니다.

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
<li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li>
<li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells%3A+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li>
<li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+der+Schaft%2C+D+%22Tissue+Eng.+Part+A%22">Tissue Eng. Part A</a>. , (2011).</li>
<li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li>
<li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche%3A+optimizing+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li>
<li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol%3A+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li>
<li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li>
<li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , In revision (2013).</li>
<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

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근육 조직의 공학 재생 의학의 약물 검사에 대한 질병 모델 등과 고기 생산을위한 사용하기위한 잠재력이 있습니다. 그러나 이러한 응용 프로그램에 대한 요구 사항은 다양합니다. 콜라겐은 세포 정렬이 가능하기 때문에 이전의 2D 연구 12 결정 myoblast의 전구 세포는 지하 막 파생 된 단백질의 존재를 필요로하기 때문에 우리는 콜라겐과 matrigel의 조합과 협력하기로 결정했습니다. 또한, 섬유소의 젤은 우리의 실험실에서 테스트하고 콜라겐과 Matrigel ™의 혼합물이 수행 특히 조직 압축 14 연결되지 않는 C2C12 myoblast 및 전구 세포를 지원하지 듯되었습니다. 셀 라인 15를 사용하는 동안 여기에 설명 된대로 모델은 압력 궤양 손상에 대한 연구에서 이미 사용되었습니다. 재생 의료 어플리케이션의 경우, 인간의 위성 세포의 번역은 최근 6,16 만든되었습니다. 또한,고기 소비 대체 소스로 기술은 잠재력이 하나 있습니다.</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Matrigel - 성장 인자가 감소 </td><td> Beckton 및 디킨슨 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM (높은 혈당) * </td><td> Gibco </td><td> 42,430 </td><td></td></tr><tr><td> 고급 DMEM </td><td> Gibco </td><td> 12,491 </td><td></td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Greiner </td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45와 0.22 μm 주사기 필터 * </td><td> Whatmann (Schleicher와 Scheull) </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tR&gt; <td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> 문화 플라스틱 </td><td> Greiner </td><td></td><td> 문화 플라스크와 피펫을 포함 </td></tr><tr><td> 칙의 배아 추출물 </td><td> 미국 생물 </td><td> C3999 </td><td></td></tr><tr><td> 파스퇴르 피펫 * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> 면, 오픈 팁 L과 수축이있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫, : 0,9의 팁 직경 230mm - 1,1 mm </td></tr><tr><td> 파스퇴르 피펫 * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> 면, 오픈 팁 L과 수축이있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫, : 1,4의 팁 직경 230mm - 1,6 mm </td></tr><tr><td> 파스퇴르 피펫 </td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase 유형 I* </td><td> 시그마 </td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> 40 μm 셀 스트레이너 * </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 19G 바늘 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 엘라스토머 </td><td> 다우 코닝 기업 </td><td> 3097358-1004 </td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> 에이전트 치료 </td><td> 다우 코닝 기업 </td><td></td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> 벨크로 </td><td> 일반 상점 </td><td></td><td> 당신은 정기적으로 상점에서이을 구입하실 수 있습니다 만 부드러운면을 사용하여 </td></tr><tr><td> 콜라겐 유형 I, 쥐 꼬리 </td><td> BD Biosciences </td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> C-페이스 EP 문화 맥박 조정 장치 </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 전기 자극을위한 6도 문화 요리 </td><td> 왜냐면kton 디킨슨 - 매 </td><td> BD 팔콘 # 353846 </td><td></td></tr><tr><td> C-접시 배양 접시 전극 </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 세포의 분리 (포인트 1.1) 필요한 # 함께 한 키트에 </td></tr></tbody></table>

전기 자극의 손쥐 myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

설계 근육 조직은 재생 의료 및 육류 대체 1로 압력 궤양을 공부하는 예를 체외에서 질병 모델로 사용하기위한 조직의 생산을 포함하는 여러 가지 목적으로 사용 할 수 있습니다. 첫 번째보고 3D 근육 구조는 몇 년 전에 만든 분야의 개척자 Vandenburgh 및 동료 2,3 아르되었습니다. 근육 조직 공학에서 만든 발전 생화학 요인, 줄기 세포 및 전구 세포에 대한 지식의 광대 한 이득의 결과뿐만 아니라하지만, 물리적 요인이 세포 행동 제어에 필수적인 역할을하는 연구자들에 의해 얻은 통찰력의 특정 기반에 있고 조직 개발. 첨단 엔지니어링 근육은 현재 셀 인구 히드로 겔 구조로 구성되어 구성합니다. 우리가 실험실에서이 일반적으로 C2C12, 미 손쥐 뒷다리 근육에서 분리 손쥐 myoblast의 전구 세포, 또는 손쥐 myoblast 세포 라인으로 구성콜라겐 / Matrigel의 혼합물로 xed 두 개의 고정 지점 사이의 도금, 근육 인대를 모방. 다른 세포는,뿐 아니라 L6 쥐 myoblasts 4, 신생아 근육 유래 전구 세포 5, 그러한 인간의 6도 유도 만능 줄기 세포 (IPS 세포) 7과 같은 다른 종에서 성인 근육 조직에서 파생 된 세포와 같은 예를 들어 다른 세포 라인을 고려 될 수있다 . 셀 수축성은 구조 8,9와 문화 약 1 주일 후에 근육 전구 세포의 분화의 긴 축을 따라 세포의 정렬을 발생합니다. 또한, 전기 자극의 응용 프로그램이 어느 정도 8로 차별화 과정을 향상시킬 수 있습니다. 때문에 그 제한된 크기 (8 X 2 X 0.5 mm)의 전체 조직은 예 생존, 분화 및 세포 정렬을 모니터링 할 공 촛점 현미경을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 특정 응용 프로그램에 enginee에 대한 요구 사항을 따라붉은 근육 조직은 경우에 따라 다릅니다, 다른 종에 고기 대체 번역이 필요한 역할을하는 동안 재생 의료에 대한 예를 들어 사용, 조직 크기와 vascularization의 최대 크기 조절이 필요합니다.

최종 제품은 그림 3에 표시된 근육 구조 될 것입니다. 조직의 크기는 길이 약 8mm, 폭 2mm와 두께 0.5 mm 될 것입니다. 차별화 동안 전기 자극은 마이 오신 중쇄 isoforms의 표현을 변경되지만, 차별화 매체 (8)에 의해 유도로 크게 차별화 프로세스를 개선하지 않지만, 전기 자극은 근육의 기능을 확인하기 위해 절차의 끝 부분에 적용 할 수 왜냐하면 완전히 개발 sarcomeres와 근육이 전기 펄스에 계약을 체결 할 수있을 것입니다. 차별화와 성숙은 조직 또는 전체 마운트 스테인드 조직 샘플로 만든 두 섹션에 근육 성숙 마커 또는 교차 결 개발 (알파 actinin에 대한 예 착색)에 대한 유전자 발현 평가 및 착색에 대한 정량적 PCR을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 근육 성숙과 차별화를 침착 하테드 유전자와 마이 오신 중쇄 표현이 예 MyoD, myogenin, MFR4 및 MLP, 그리고 M...

설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

공학적으로 설계된 근육 조직은 여러 가지 다양한 목적으로 사용될 수 있으며, 여기에는 예를 들어 ...를 위한 인비트로(in vitro) 질환 모델로 사용될 조직의 제작 등이 포함됩니다.

이 프로시저의 전반적인 목적은 엔지니어링된 근육 조직을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 위성 세포 또는 근아세포 세포주를 배양하여 필요한 세포 수를 확보함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 앵커링 지점을 만드는 것입니다.다음으로, 세포를 겔과 혼합하고 생성된 혼합물을 앵커링 포인트 사이에 캐스팅합니다. 마지막 단계는 세포를 근육 조직으로 분화시키는 것입니다. 최종적으로, 전기 자극을 통해 세포의 수축을 유도할 수 있으며, 형광 염색과 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 분화된 근육 세포 내 세포골격의 근절 조직화를 검출할 수 있습니다.기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 조직 내에서 근육 세포가 한 방향으로 정렬된다는 점입니다. 또한, 이 기술은 근육 손실을 겪는 환자들에게도 시사하는 바가 큽니다. 예를 들어, 향후 환자 자신의 세포를 사용하여 이러한 조직을 제작한다면, 이를 이식 목적으로 활용할 수 있습니다.이 방법은 근육의 발달과 근육 손상에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 재생 의학 및 체외 배양육과 같은 새로운 응용 분야에 대한 통찰도 제공할 것입니다. 본 절차는 다른 곳에서 설명된 근육모세포 전구세포의 분리 및 동결 방법을 시연할 것입니다.전체 참조 문헌은 서면 프로토콜을 확인하시기 바랍니다. 액체 질소에서 마우스 근아세포 전구세포 바이알을 꺼낸 후, 37 °C의 항온수조에 넣어 해동합니다.그런 다음 25 $\text{cm}^2$ Matrigel 코팅 조직 배양 플라스크에 데워진 배지 10 mL를 넣습니다. 세포가 해동되는 즉시 바이알의 내용물을 배지에 첨가합니다. 조직 배양 플라스크에서 세포를 37 °C, 5% $\text{CO}_2$ 조건으로 배양합니다.배양 3일째에 트립신 처리, 세포 분리 및 원심분리를 통해 세포를 수확합니다. 1000 RPM에서 원심분리한 후, 세포를 75 cm² Matrigel 코팅 조직 배양 플라스크로 계대 배양합니다. 3일마다 세포를 분할하며, 6일째에 세포를 150 cm² Matrigel 코팅 조직 배양 플라스크로 계대 배양합니다. 9일째에 150 cm² Matrigel 코팅 조직 배양 플라스크의 세포를 150 cm² Matrigel 코팅 조직 배양 플라스크 3개로 옮깁니다.배양 12일 차에 세포를 근육 구조물에 파종할 준비가 됩니다. 먼저 이 도식에 표시된 것처럼 한쪽 가장이가 삼각형 모양인 약 5mm² 크기의 벨크로 조각을 자릅니다. 이때 벨크로의 부드러운 면만 사용합니다. 그런 다음 엘라스토머와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 실리콘 접착제를 준비합니다.그런 다음 6-웰 배양 플레이트의 각 웰에 벨크로 두 조각을 붙이되, 조각 사이의 간격을 약 12 millimeters로 두고 하룻밤 동안 건조시킵니다. 다음 날, 웰에 70%ethanol을 넣고 15분 동안 배양하여 웰과 벨크로를 멸균합니다. 이어서 PBS로 웰을 세 번 헹굽니다.세 번째 세척액을 웰에 그대로 두고 플레이트를 15분 동안 UV 광선에 노출시킵니다. 그 후 PBS를 흡입하여 제거하고, 사용 준비가 될 때까지 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 3.2 mg/mL 농도의 콜라겐과 멸균된 0.02% acetic acid 용액을 준비합니다.냉장고에서 미리 해동해 둔 matrigel 용액과 함께 콜라겐 용액을 얼음에 둡니다. 다음으로, 트립신 처리와 원심분리를 통해 세포를 회수합니다. 그 후 세포 펠렛을 성장 배지에 재현탁하고 표준 절차에 따라 세포 수를 측정합니다.세포 수를 측정한 후, 세포가 담긴 튜브를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 매트릭스 용액은 51.3%의 Collagen solution 0.2%, 0.5 molar sodium hydroxide, 8.6%의 matrix gel, 그리고 39.9%의 growth Medium을 얼음 위에서 혼합하여 준비합니다. pH가 상승하면 급격한 중합이 일어날 수 있으므로, 최종 용액의 색상이 분홍색인지 확인하십시오.최종 부피는 플레이팅할 웰의 수에 따라 달라집니다. 이 표는 근육 10개에 대한 부피를 보여줍니다. 세포가 완전히 재현탁되었는지 확인하고, 구조체당 750, 000에서 1, 250, 000개의 세포를 새 원심분리 튜브로 옮겨 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 흡입하고 세포 펠렛을 매트릭스 혼합물의 소량이지만 충분한 부피로 재현탁하십시오.펠렛이 완전히 재현탁되면, 세포를 나머지 부피의 매트릭스 혼합물에 추가합니다. 이제 인큐베이터에서 예열된 플레이트를 꺼내어 각 벨크로 조각에 세포 매트릭스 혼합물 0.35 to 0.4 milliliters를 파이펫팅합니다. 그런 다음 부착 부위 사이의 중심에서부터 혼합물을 파이펫팅하기 시작하여 벨크로까지 확장합니다.마지막으로, 남은 젤을 사용하여 두 벨크로 앵커 사이의 빈 공간을 채우고 벨크로 조각 주변에 피펫팅합니다. 플레이트를 덮고 상온에서 5분에서 10분 동안 둡니다. 그다음 디쉬를 가볍게 두드려 젤이 단단해졌는지 육안으로 확인합니다.그렇다면, 디쉬를 조직 배양 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다. 인큐베이터에서 1~2시간 후, 각 겔 위에 4 mL의 예열된 성장 배지를 조심스럽게 덮어줍니다. 그런 다음 플레이트를 다시 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다.24시간 후, 성장 배지를 분화 배지로 교체합니다. 2~3일마다 배지 교체를 반복합니다. 배양 7일째가 되면 성숙하고 정렬된 근섬유가 나타나야 합니다.이 단계에서 섬유에 전기 자극을 줄 수 있습니다. 먼저, 이온 광학 플레이트의 전극을 70% ethanol로 15분 동안 멸균하고 UV 램프 아래에서 30분 동안 건조합니다. 그런 다음, 플레이트 바닥을 보여주는 이 사진에서와 같이 전극이 근육 구조물과 평행하게 배치되도록 멸균된 전극을 배양 플레이트에 놓습니다. 흰색 화살표는 플레이트의 덮개를 덮은 전극을 나타내며, 이를 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다.이온 광학 C 페이서(ion optic C pacer)를 적절한 케이블로 연결하고 여기에 자극 프로토콜을 적용합니다. cm당 4V, 2Hz의 주파수로 6ms 펄스를 사용합니다.전기 자극은 보통 48시간 동안 수행합니다. 자극이 진행되는 동안 24시간마다 배양액을 교체하십시오. 이 이미지는 성숙한 근육 구조물의 전형적인 예를 보여줍니다.조직의 크기는 길이는 약 8 mm, 너비는 2 mm, 두께는 0.5 mm입니다. 이 이미지는 공학적으로 설계된 골격근 조직 내 근육 전구세포의 전형적인 예를 보여줍니다. 자극을 주지 않은 미러링 바이오 인공 근육(mirroring bio artificial muscles) 또는 M bms의 동결 절편입니다.분화 8일 차에 sarcomeric alpha actinin(빨간색), sarcomeric myosin(초록색) 및 핵(파란색)으로 염색하였습니다. 오른쪽 패널은 상자 표시된 영역을 확대한 것입니다. 이 프로토콜은 C2C12 세포에도 적용할 수 있습니다.이 이미지는 마지막 이미지와 동일한 방식으로 염색된 분화된 C2C12 세포를 보여줍니다. 근절 알파 액티닌(Sarcomeric alpha actinin)은 빨간색으로, 근절 마이오신(Sarcomeric myosin)은 초록색으로, 핵은 파란색으로 표시되어 있습니다.다시 한번 설명하자면, 오른쪽 패널은 상자로 표시된 영역을 확대한 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 시료를 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는, 발현 이후의 유전자 발현 수준 변화를 입증하기 위한 quantitative PCR과 같이 추가적인 질문에 답하기 위한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술은 연구자들이 조직 형태 형성에서 역학의 역할을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 또한, 공학적으로 설계된 심근 모델의 제작에도 기여하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 하이드로젤 기반 스캐폴드를 사용하여 공학적 근육 조직을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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