Name: 헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 배우세요 신생아 마우스에서 분리한 진피와 표피 세포를 이용한 유전자 조작 기법으로 모낭 재생에서 상피-중간엽 시그널링을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 3주 만에 유전자 기능을 평가할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA)와 NIH 보조금 AR052785 및 AR046786 (AEO 및 W.-MW)에 의해 지원되었다.

1. 피부 절개 0으로 2 살 신생아 마우스를 준비합니다 <ol><li> 적어도 20 분 동안 CO 2 챔버를 사용하여 마우스 새끼를 안락사시켜야. 최대 해부까지 시간을 얼음에 새끼를 남겨주세요. P0-P2 마우스는 매우 오래된 마우스로 준비된 세포로 추천하는 것은 전구 용량을 감소 낮은 그라프 트 수율의 결과가. 70 % 에탄올 중 하나 접시 (단계 1.3) 및 세척 솔루션의 세 요리 (3 단계 용)을 준비 할 때 피부 절개를 수행 할 준비가. Dispase 솔루션을 해동와 4에서 떠나 ° C. 자궁 경부는 안락사을 보장하기 위해 CO 2 과다 노출 후 새끼를 탈구. </li><li> 얼음과 살균 흐름 후드에 양도 문화 접시에 euthanized 새끼를 놓습니다. </li><li> 간단히 무균 배양 접시로 70 %의 에탄올과 장소에 immersing하여 새끼를 씻으십시오. </li></ol> 2. 마우스 스킨 해부 <ol><li> 멸균 가위로 몸의 기초에서 각 사지와 꼬리를 자르면. </li><li> CU 한 쌍의 사이에 단단히 몸을 파악rved 포셉과 머리에서 기본 근막을 관통하지 않고 메스를 사용하여 꼬리에 등쪽 피부를 따라 절개를합니다. </li><li> 조심스럽게 거리에 마우스의 중간 선에서 피부 껍질을 벗기다. </li><li> 곡선 포셉의 긴 쪽을 단단히 노출 된 마우스를 잡고 마우스의 뒤쪽 끝의 피부 아래 곡선 포셉의 다른 쌍을 삽입하고 부드럽게 마우스의 복부 이분의 일을 향해 허리를 통해 피부를 당겨. </li><li> 조심스럽게 한 부드러운 움직임에서 완전히 마우스에서 피부 껍질과 시체를 폐기하십시오. </li></ol> 3. Dispase 솔루션으로 피부와 품다을 씻으십시오 <ol><li> 진피 측과 세척 솔루션의 첫 번째 접시의 피부를 배치합니다. 피부를 확산하고 포셉으로 활발히 논의. 다음 피부를 박리하면서 세척 솔루션의 첫 번째 접시에 피부를 둡니다. </li><li> 세탁 솔루션의 첫 번째 접시에 다음 해부 피부를 삽입 한 후, 세탁 솔루션의 두 번째 접시에 전에 피부를 전송할 수 있습니다. 일의 스킨을 유지전자 초 세탁 솔루션을 모두 스킨가 수집 될 때까지. 최종 세척 스킨의 모든 전송, 간단히 활발히 논의. </li><li> 멸균 10cm 문화 요리에 10 ML의 얼음 차가운 Dispase을 추가합니다. Dispase 솔루션으로 피부를 갈아 피부 진피 쪽을 평평하게. </li><li> 4에 8-16 시간에 피부에 띄워 ° C (대체 옵션 : 1 시간 37 번 ° C). </li></ol> 4. 별도의 진피와 표피 <ol><li> 새로운 멸균 배양 접시에 피부를 갈아 피부 진피 쪽을 평평하게. 메스과 하나가 코너에서 진피를주의 깊게 누르십시오. </li><li> 집게로 표피를 잡고 천천히 벗겨 버릴 진피에서. 표피는 차로 한 조각으로 껍질을 해야지. 표피는 흰색과 얇은되며 진피는 갈색 두꺼운, 그리고 젤라틴해야합니다. </li><li> 별도의 멸균 문화 요리에 두 조직을 분리합니다. <ol class="lalpha"><li> 피부 특정 유전자 최저 / overexpression 이식을 만들려면 진피를 타고 t 매우 작은 조각으로 잘게 썬 고기앨리스의 메스. 표피를 폐기하십시오. 감염 (7 단계)의 일에 lentiviral에 감염된 피부 세포와 결합하는 신선한, 치료 표피 세포를 준비하는 마우스 스킨의 또 다른 세트를 해부. </li><li> 표피 특정 유전자 최저 / overexpression 이식을 만들려면 6에 각각의 표피를 갈라 - 8 작은 조각입니다. 진피를 폐기하십시오. 감염 (7 단계)의 일에 lentiviral에 감염된 표피 세포와 결합하는 신선한, 치료 피부 세포를 준비하는 마우스 스킨의 또 다른 세트를 해부. </li></ol></li></ol> 5. 다진 조직에서 기본 마우스 피부 세포를 (mDCs) 해리 <ol><li> 1 시간에 37 ° C에서 갓 만든 Collagenase 솔루션과 피부 조각을 잠복기에 의해 mDCs을 떼어 놓다. 강아지 마우스 당 Collagenase 솔루션의 10 ML을 사용합니다. </li><li> 부드럽게 솔루션이 포함 된 진피마다 10 분 섞는다. 현미경으로 분리의 정도를 확인하고, 소화 세포 현탁액은 주로 단일 세포해야합니다. 이 솔루션은 분명의로 흐린로 변경해야합니다피부 세포는 진피에서 dissociated 있습니다. </li><li> collagenase의 활동을 줄이기 위해 10 % 최종 볼륨에 진피를 포함하는 Collagenase 솔루션에 FBS를 추가합니다. </li><li> 대형 소화되지 않은 clumps 및 전체 모낭을 제거 할 수있는 새로운 50 ML 튜브에 70 μm 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 30 ML 당 DMEM/10 % FBS의 10 ML을 추가 흐름을 통해 더욱 collagenase를 희석 할 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기 튜브는 더 전체 모낭을 제거하는 5 분을위한 탁상 원심 분리기 30 XG에 소화 진피를 포함하는. </li><li> 새로운 50 ML 튜브에 표면에 뜨는을 자세히 전송합니다. 5 분의 탁상 원심 분리기에 200 XG에 centrifuging하여 펠렛 세포. </li><li> DMEM/10 % FBS와 세포 (강아지 당 1 ML)를 Resuspend하고 세포를 계산합니다. 감염 Amniomax C-100 미디어 (7 단계)와 플레이트 세포, 또는 (9 단계) 접목을 위해 lentivirus에 감염된 KC와 결합합니다. 일반적으로 수율이 새끼 20 X 10 6 세포입니다. </li></ol> 6. 기본 Keratinocyte을 떼어 놓다다진 조직에서 S (KC) <ol><li> 15 분에 37 ° C에서 갓 해동 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 표피 조각을 잠복기에 의해 KC을 떼어 놓다. 강아지 마우스 당 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 7 ML을 사용합니다. </li><li> 표피마다 5 분을 포함 부드럽게 소용돌이 솔루션입니다. </li><li> 트립신의 활동을 줄이기 위해 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 함유 표피에 중화 솔루션의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 5 분의 탁상 원심 분리기에 200 XG에 centrifuging하여 펠렛 세포. 남은 소화되지 않은 조직 위에 떠해야합니다. </li><li> 조심스럽게 소화되지 않은 조직으로 표면에 뜨는 대부분을 부어. 교란 세포 펠렛없이 10 ML의 피펫으로 남아있는 표면에 뜨는을 제거합니다. PBS로 세포 펠렛을 Resuspend. 경우 관세청에서 완전히 pelleted 없으며, 표면에 뜨는 대부분을 날려 부어과 세포의 대부분은 pelleted 때까지 원심 분리를 반복합니다. </li><li> 나머지 조직 또는 clumps을 제거 할 수있는 새로운 튜브에 70 μm 전지 스트레이너를 통해 세포 현탁액 스트레인. </li><li> centrifuging의 펠렛 세포5 분의 탁상 원심 분리기에 대한 200 XG에서. </li><li> CNT-07 미디어 또는 PBS (강아지 당 1 ML)과 카운트 세포에 Resuspend 세포. 감염 도금 세포 (7 단계)에 대한 CNT-07를 사용하여 (단계 9) 접목을 위해 lentivirus에 감염된 mDCs와 결합하는 PBS를 사용합니다. 일반적으로 수율이 새끼 당 3-10 X 10 6 세포입니다. </li></ol> 7. shRNA 또는 cDNA를 포함 Lentivirus과 기본 셀을 감염 감염의 날 (9 단계) 접목의 날에 바이러스에 감염된 세포와 결합하는 신선한, 치료 기본 관세청 또는 mDCs을 준비하는 마우스 스킨의 또 다른 세트를 해부. <ol><li><ol class="lalpha"><li> mDCs를 들어, 번호판 4 × 10 37 번 AmnioMAX-C100 미디어 및 배양과 10 cm 판 당 6 mDCs ° C 50 %의 세포 밀도에서 다음 날 감염 + 5 % CO 2. mDCs의 보통 3-4 플레이트는 이식을 생성하는 데 사용됩니다, 그리고 10-12 플레이트의 총은 한 실험에서 세 이식을 생성하기 위해 필요합니다. 또한, mDCs 첨부 해와 f를 확산또는 37 번 2 시간의 최소 ° C + 5 % CO 2, 감염 할 셀 도금의 동일한 일을 수행합니다. mDCs는 섬유 아세포 - 좋아 형태를 갖게됩니다. </li><li> KC를 들어, 판 12 × 10 37 번 CNT-07 미디어 및 배양과 10 cm 판 당 6 KC ° C 다음 날 감염 + 5 % CO 2. 또한, KC는 37 2 시간의 최소 연결하고 확산 해 ° C + 5 % CO 2와 같은 날에 감염을 수행합니다. KC의 보통 3-4 플레이트는 이식을 생성하는 데 사용됩니다. 10-12 판의 총은 한 실험 세 이식을 생성하기 위해 필요합니다. 관세청은 조약돌 형태를 갖게됩니다. </li></ol></li><li> 37 8 μg / ML의 Polybrene 솔루션 ° C + 5 % CO 2 5-10 분을위한 세포를 Preincubate. </li><li> 교환 매체와 lentivirus를 추가 + 8 μg / ML의 Polybrene 솔루션입니다. Lentiviral titer는 구성 사용하고 감염되기 전에 결정되어야한다에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 32에서 1 시간을위한 테이블 원심 분리기에 200 XG에서 번호판을 원심 분리기 °, lentivirus와 세포를 감염시킬 수 C. </li><li> lentivirus 함유 미디어를 제거하고 신선한 미디어를 추가 할 수 있습니다. KC를 들어, 신선한 미디어를 다시 추가하기 전에 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 보통 감염된 세포는 회복 37 번 밤새 ° C + 5 % CO 2.주세요 또한, 37에서 복구 적어도 두 시간을 허용 ° C 이식을위한 세포를 trypsinizing 전 + 5 % CO 2. 대표 결과 섹션에 설명 된대로 감염 효율을 확인하기 위해 문화 감염된 세포의 작은 부분을 계속합니다. </li></ol> 8. 이식에 감염된 세포를 준비 <ol><li> 단계 4-6를 사용하여 피부의 신선한 기본 mDCs 또는 관세청를 분리합니다. 얼음 차가운 멸균 PBS에 Resuspend 세포. 셀을 계산합니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 피부 특정 유전자 최저 / overexpression 이식의 경우, 8 분 동안 37 ° C에서 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용하여 판에서 감염된 mDCs을 떼어 놓다. </li><li> 표피 특정 유전자 최저 / overexpression 이식의 경우, 접시 usi에서 감염된 KC을 떼어 놓다37 번 NG 0.125 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ° 15 분에 C. </li></ol></li><li> DMEM + 10% FBS (mDCs) 또는 중화 솔루션 (KC)를 사용하여 트립신 활동을 중화. 50 ML 튜브에 trypsinized 세포를 전송합니다. </li><li> 5 분의 탁상 원심 분리기에 200 XG에 centrifuging하여 펠렛 세포. </li><li> 얼음 차가운 멸균 PBS에 Resuspend 세포. 셀을 계산합니다. </li><li> 신선하게 조리 된 치료 대응 세포 유형의 바이러스에 감염된 세포를 결합합니다. 이식의 경우, 4 ° C.에 얼음 차가운 무균 PBS와 펠렛 탁상 원심 분리기에있는 세포 슬러리의 7-10 X 10 6 관세청과 7-10 X 10 6 mDCs을 결합 50 -100 μl 얼음 차가운 무균 PBS에 Resuspend 세포. 뉴 / 뉴 마우스 챔버 준비가 될 때까지 얼음에 세포를 유지. </li></ol> 9. 뉴 / 뉴 마우스를 위로에 상처 침대와 수정 회의소를 만듭니다 접목 전에 하루, 70 % 에탄올에 몸을 담글 수에 의해 압력솥 및 무균 실리콘 챔버와 수술 도구를 소독. 70 % etha 교체챔버를 사용하기 전에 멸균 PBS로 nol. <ol><li> 마취 뉴 / 뉴 마우스 (7-12주 세 여성)는 intraperitoneal 주사 (100 μl/10 g의 체중) 또는 기타 선호하는 방법으로 케타민 (8 MG / ML) / xylazine을 (1.6 밀리그램 / ML)를 사용하여. 눈 윤활유를 적용합니다. 마우스 아래의 장소 가열 패드. </li><li> 요오드와 누드 마우스 다시 피부를 소독하고 알코올 면봉으로 청소하십시오. </li><li> 1-3 붙이기 절개 사이트에 0.25 % Bupivicaine을 떨어 추가 할 수 있습니다. 포셉과 목의 기지에서 누드 마우스 뒤로 피부를 꼬집어. </li><li> 멸균 가위로 몰아 피부에 작은 원형 구멍을 (직경 ~ 1 ㎝) 자른다. </li><li> 상처 침대에 멸균 실을 배치하고 피부를 주변과 챔버 가장자리를 다룹니다. </li><li> 그림 2A와 같이 챔버 가장자리를 따라 봉합 (챔버 당 6 바늘)과 장소에 보안 실. </li><li> 방 준비가, 부드럽게 소용돌이 모양의 세포 슬러리 및 1 ML의 주사기에 부착 된 23 게이지 바늘로 최대립니다. 세포 슬러리는 부드럽게, 바닥에 응축 한 경우바늘로 그리기 전에 1 ML의 피펫 팁을 resuspend. </li><li> 주사 바늘로 실 천천히 상처에 세포를 똑. </li><li> 깨끗하고 autoclaved 케이지에 배치 마우스. 집이 케이지 당 마우스 및 식수에 항생제와 타이레놀 (3 MG / ML)를 추가합니다. 우리의 경험에서, 케이지 당 두 여성의 마우스는 불리한 챔버에 외상, 이식, 또는 동물을 초래하지 않았습니다. </li><li> 반은 케이지에서 온난화 패드를 놓고 마취 떨어지기까지 쥐를 관찰합니다. </li></ol> 10. 7-9 일 후에 회의소를 제거 <ol><li> 단계 9.1에서와 같이 쏠 뉴 / 뉴 마우스를 마취. 눈 윤활유를 적용합니다. </li><li> 요오드와 실 주위에 피부를 소독하고 알코올 면봉으로 청소하십시오. </li><li> 조심스럽게 바늘을 잘라 챔버에서 제거합니다. </li><li> 부드럽게 마우스에서 챔버를 제거합니다. 챔버에 새로운 피부 이식 스틱은 집게를 사용하여 챔버에서 챔버의 일부 부드럽게 별도의 이식을 들어합니다. 챔버의 제거 동안 그라프 트를 누르십시오. 수술이 화장실해야그림 2B와 같이 K 둔하고 불투명. </li><li> 장소 (2 바늘)에 열려있는 상처 봉합 항생제의 박막과 비 점착성의 패드를 적용합니다. </li><li> 패드를 보호하고 상처를 보호하기 위해 마우스 주위에 붕대를 넣어. 장소에 붕대를 봉합 해. </li><li> 실리콘 챔버는 순한 비누로 청소하여 세척하고 철저하게 탈 이온수로 헹구어 있습니다. 70 %의 박 에탄올, 공기 건조 및 저장에 방을 만끽 해보세요. </li></ol> 11. 헤어 성장을위한 마우스 검사 <ol><li> 챔버 제거 3 일 후에 붕대와 패드를 제거합니다. 수술이 건조하고 색 갈색에 불투명해야합니다. </li><li> 헤어 성장 정기적으로 쥐를 확인합니다. 머리카락 이식 후 16일에 게재되기 시작합니다. </li></ol> 절차 개요 1 일하면 (2-3 시간) : 신생아 새끼를 희생 피부를 제거, 4 ° C 하룻밤에 dispase에 출발합니다. 2 일 (2-3 시간)는 : 피부의 기본 세포를 분리하고권장 세포 밀도의 판. 3 일 (3-4 시간) : lentivirus와 세포를 감염. 신생아 새끼의 또 다른 집합의 피부를 제거하고 4 ° C 하룻밤에 dispase에 출발합니다. 4 일 (6-8 시간) : 피부의 기본 세포를 분리, 셀, 그리고 얼음에 출발합니다. trypsinization 및 원심 분리에 의해 lentivirus에 감염된 세포를 복구, 계산 및 그라프 트 당 PBS의 50-100 μl에 7-10 X 10 6 피부 세포와 keratinocytes 조화를 이루고 있습니다. 마우스 상처 침대를 만들 챔버를 부착, 침대 상처를하기 위해 세포 혼합물을 적용 할 수 있습니다. 대체 절차 개요 대체 절차 개요 나흘에서 세 절차를 단축합니다. <ol><li> 1 시간 (예정 시간 5-7 시간)에 37 ° C에서 dispase에 마우스 스킨을 치료하여 주 1 일이 조화를 이루고 있습니다. </li><li> 두 시간 동안 도금 세포 (예상 시간 5-7 시간) 이후에 lentivirus와 세포를 감염시켜 주 2 주 3 조화를 이루고 있습니다. </li></ol>

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헤어 reconstitution의 assays는 드 노보 헤어 소낭 형성의 메커니즘을 조사에 대한 고유 한 장기 재생 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 헤어 소낭 형성에 유전자 기능을 결정하는 데 유용 수정 챔버 헤어 분석을 설명합니다. 우리 검정 우리가 피부 또는 표피 세포 유형 중 하나에 유전자 overexpression 또는 분해를 달성하기 lentiviral 표현 기법을 소개하도록 수정보고 챔버 헤어 reconstitution 분석 5, 6,11,에 기반을두고 있습니다. 우리 분석은 조직 별 유전자 녹아웃을 생성 할 수있는 빠른 대안을 제공합니다. 이 분석은 우리가 그라프 트 컬렉션에 lentivirus와 기본 세포를 감염에서 최소 셋처럼 주 헤어 소낭 형성에 유전자 기능을 설명 할 수 있습니다. 우리 검정은 한 셀 타입 12에 lentivirus에 의해 조합 shRNA / cDNA 전송을 사용하여 유전자 상호 작용을 해결하기 위해 확장 할 수 있습니다뿐만 아니라 피부 및 표피 세포 사이에 신호의 일반 시험을 할 수 있습니다에스. 미묘한 결함이 관찰 어렵 동안 우리의 머리 분석은 가장, 헤어 소낭 재생에 강한 이득 또는 손실 기능 phenotypes을 검출에 적합합니다. 우리는 성공적으로 우리의 머리 재생 분석 1,12를 사용하여 몇 가지 유전자의 피부 특정 유전자의 기능을 보여주고 있습니다. GFP 마커에 따라 shRNA 10을 표현 lentivirus 벡터에서 공동이 - 표현, 우리는 기증자 피부 세포를 표현 shRNA가 생성 헤어 이식에 지속되는 보여 주었다. GFP 양성 세포는 재생 모낭 (그림 3)의 피부 유두 (DP)에 참석했다. 셀 따라서 관찰 헤어 소낭의 표현형은 null로 유전 hypomorph에서 다양한이었고, GFP의 수준을 다양한 표현으로 DP 세포 가능성이 유전자 최저의 다른 수준으로 구성. 이 분석에 대한 하나의 개선 graftin 전에 높은 shRNA 표현 세포에 대한 신속하고 효율적인 선택을 확립하는 것입니다g 강한 GFP-표현 세포를 정화하기 위해 FACS를 사용하여 같은. 대안이 검정 9 돌연변이 또는 조건부 녹아웃 세포를 대체하는 것입니다. 기본 피부 세포 passaged하고 나면 DP의 효력이 점차 손실로 다른 한편으로는, DP 세포 기능을 보존 할 수있는 문화 시스템은 매우 유용합니다. 잠재적 인 문화 시스템은 인공 틈새 또는 집계 문화 2,7,8,13에서 파생 biomaterials의 사용을 포함합니다. 또 다른 개선이 피부에 특정한 손실 또는 신선한 keratinocytes 생성하기 위해 마우스 새끼의 두 번째 세트 (7 단계)의 사용을 줄일 수로 높은 휴대 복구 속도 신뢰할 수있는 표피 세포 동결 방법 이득의를 생성하는 것입니다 기능을 연구. 머리 성장이 약간은 덜 동기화 고치 방향이 더 무작위입니다 있지만, 이러한 챔버 헤어 분석, 헤어 소낭 밀도와 일반 마우스 피부와 유사한 품질을 생산하고 있습니다. 머리 재생 유전자 분석의 몇 가지 제한이 includ전자 lentivirus와 전화 번호의 대량의 요구 사항, 그리고 이러한 패치와 플랩 assays 3,4,14 등의 헤어 reconstitution의 assays 다른 형태의에 비해 수술 방법의 측면에서 집중적 매우 노동입니다. 그러나, 머리의 성장을 감지하는 모낭과 타임 라인의 질은 다른 assays 4 우수합니다. 우리 목표 헤어 재생 분석은 기존 유전 모델에 빠르고 편리 동반자를 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> # 카탈로그를 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td> 셀 N TEC </td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100의 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 로슈 </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, 1 형 </td><td> 시그마 </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> 시그마 </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> 조직 배양 접시 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> 해부 가위 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 10-275 </td><td> 곡선 </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex 공급 </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> 크기 안돼. 10 </td></tr><tr><td> 70 μm 세포 stainer </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 원심 분리기 관 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-959 - 49D </td><td></td></tr><tr><td> 알코올 면봉 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 게이지 바늘 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-821 - 13F </td><td></td></tr><tr><td> 눈 윤활유 </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone - lodine의 면봉 </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 회의소 </td><td> Renner GmbH의 </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> 봉합 </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> 유연한 붕대 </td><td> 피셔 과학 </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> 비 점착성의 드레싱 </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 자료 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션을 씻으십시오 PBS 500 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 12.5 μg / ML Fungizone 100 μg / ML Gentamycin Dispase 솔루션 HBSS 2.5 MG / ML 최종 Dispase 100 μg / ML Gentamycin 중화 미디어 HBSS 15 % (V / V) FBS Collagenase 솔루션 0.25 % (w / V) Collagenase, 제 1 형 ontent &quot;&gt; 100 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 2.5 μg / ML Fungizone 50 μg / ML의 Gentamycin Polybrene 솔루션 HBSS 8 μg / ML (w / V) Polybrene </td></tr></tbody></table>

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

헤어 소낭의 morphogenesis, 상피 조직이 나왔죠 파생 keratinocytes과 기본 mesenchyme 간의 상호 작용을 필요로하는 복잡한 과정은 장기 개발 및 조직 별 신호를 공부 할 수있는 매력적인 모델 시스템입니다. 헤어 대과 개발이지만이 과정에 필수적인 요소의 유전자 다루기 쉬운, 빠르고 재현 분석은 도전 남아 있습니다. 여기 타겟팅 overexpression 또는 조직 별 방식으로 lentivirus를 사용하여 요소의 shRNA로 인한 최저를 생성 할 수있는 절차를 설명합니다. 헤어 재생 모델 5, 6, 11의 수정 된 버전을 사용하여, 우리는 헤어 소낭의 morphogenesis로 이어질 상피 - 중간 엽 신호 경로의 연구를 촉진하기 강력한 이득 또는 기본 마우스 keratinocytes 또는 피부 세포의 손실 기능 분석을 달성 할 수 . 우리는 lentivirus contai을 제공, 신선한 기본 마우스 keratinocytes과 피부 유두 세포 및 전구 물질을 포함 피부 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다세포 인구 중 하나에 shRNA 또는 cDNA 중 하나를 닝, 그리고 누드 마우스 실려 완전히 형성 모낭을 생성하는 세포가 조화를 이루고 있습니다. 이 방법은 3 주 이내에 모낭을 생성하는 데 필요한 조직 별 요인의 분석이 가능하고 기존 유전 모델에 빠르고 편리 동반자를 제공합니다.

그림 1에서 우리는 3 주 이전 재생 헤어 이식에 Smoothened (SMO), 중요한 쉬 신호 구성 요소의 피부 별 lentiviral shRNA의 최저의 결과를 보여줍니다. 혼자 lentiviral 벡터를 사용하여 제어 이식은 강력한 머리 성장 (그림 1A)를 보여줍니다. 반대로, 머리 성장 (그림 1B)의 손실 SMO 결과의 피부 별 최저. Hematoxylin 및 eosin 얼룩은 머리 컨트롤의 모낭 및 실험 조건 (그림 1C, D)의 단계를 도시한다. 유사한 치료에서 헤어 성장 표현형은 lentiviral 벡터 혼자 감염 긍정적 인 제어를 포함하여, 실험 중 변수가 될 수 있습니다. 따라서 긍정적 인 제어 이식은 항상 이식의 30 %가 흉터 나 이식의 불완전 첨부 파일의 결과로 실패 수 있기 때문에 레퍼런스로 모든 실험에 포함되어야합니다. 다시 한 요소의 cDNA 등 overexpressing과 같은 두 가지 요소 사이의 상호 작용을 테스트의 경우다른 요소의 scue shRNA로 인한 최저는, 하나는 항상 매니페스트 각 실험의 손실 함수 결과를에 최저 혼자 이식을 포함해야합니다. 이는 특정 유전자가 머리 소낭 재생 경로와이 유전자의 상호 작용을 perturbs 방법을 결정하는 데 필요한 범위를 제공합니다. 챔버 (그림 2A)의 제거는주의 수행해야합니다. 새로 형성된 수술이 무딘 표면 (그림 2B)로 약간 불투명해야합니다. 수술이 이식은 상처 침대에 부착 남아 있는지 확인하는 것이 중요합니다 그래서 부드럽게 한쪽 리프팅, 챔버에 충실 할 수 있습니다. 수술이 사흘 뒤에 상당히 안정적이며, 드레싱을 제거 할 때 약간의 어려움을 제시해야합니다. 강력한 머리 성장은 세 주 (그림 2C) 이후에 관찰해야합니다. mDCs이나 관세청 중 하나를 생략하면 어떤 머리를 (그림 2D) 11없이 복구 상처 부위에 발생합니다. 중 하나에서 세포 사망이나 셀 손실그림 1b에 도시 된 바와 같이 피부 - SMO 최저의 감소 ​​헤어 재생 대조적으로 머리카락의 세포 유형은 또한 결과. 성공적인 분석을 보장하기 위해, 그것은 접목하기 전에 적절한 overexpression 또는 최저 효율보다 90 % 이상 세포의 바이러스 감염을 달성하기 위해 중요합니다. 접목 절차의 시간 제약으로 인해, 우리는 접목 실험을 시작하기 전에 문제가 촬영 바이러스 감염 효율을 추천, 항상 손실 또는 이득의 표현을 확인하기 위해 절차를 접목 당일 셀의 일부를 저장합니다. Lentiviral titer는 구성 사용하고 감염이 90-100% 효율을 달성하기 전에 결정해야에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 lentiviral 벡터에서 coexpressed GFP과 바이러스 성 감염 효율을 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 분해 또는 overexpression의 범위를 결정하는 정량 PCR 및 / 또는 서양 얼룩을 수행합니다. 라벨 형광 태그 듀얼 표현 벡터를 활용급속도로 이루어질 감염 세포는 신호와 성숙 이식에서 우리의 구조를 표현하는 세포 수의 perdurance를 신고 할 수있는 방법을 제공합니다. 우리는 lentiviral 벡터 SMO shRNA와 함께 pSicoR-CMV-GFP 10에서 CMV 프로모터에 의해 구동 GFP를 사용합니다. 그림 3에서, 우리는 GFP가 대표 헤어 소낭의 피부 유두에 lentivirally - 표현된다 3 주 오래된 피부 별 이식을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> 1 그림. 헤어 대과 성장의 조직 학적 분석. (A) 빈 lentiviral 벡터 및 치료 keratinocytes에 감염된 피부 세포를 제어 헤어 재생 이식의보기. (B) 피부 세포에 lentiviral shRNA를 사용하여 Smoothened 최저의 모공 손실의 치료 keratinocytes 결과와 결합. (C) Hematoxylin 및 eosin의 착색은 anagen 헤어 f를 보여줍니다제어 이식에 ollicles은 진피로 내려 확장 및 (D) Smoothened 최저의 모낭은 저하하고 대부분 결석 남아 있습니다. 모든 이미지, 3 주 접목 후입니다. 스케일 바는 100 μm를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> 그림 2. 기본 세포를 이식. 봉합 실 주택 기본 피부 세포와 keratinocytes가있는 (A) 뉴 / 뉴 마우스. (B) 챔버의 제거가 새로 둔하고 성격의 불투명 한 것을 피부를 형성 제공합니다. (C) 이식에 완전히 성장 머리카락 사용 야생 접목 후 삼주의 주요 피부 세포와 keratinocytes을 입력합니다. (D) keratinocytes없이 주요 피부 세포의 추가는 3 주 후에 머리카락이 발생합니다. 비슷한 결과는 피부 세포가없는 기본 keratinocytes의 추가로 볼 수 있습니다. 그림 3. 3 주 이전 생성 그라프 트에서 피부 유두의 피부 유두에서 GFP의 표현의 유지 보수. 공 촛점 이미지. GFP는 lentiviral 벡터에서 피부 세포 인구로 표현하고 피부 유두 (녹색)에 감지되었습니다. Versican (빨간색)는 피부 유두와 핵은 Hoechst (파란색)과 라벨했다 demarcates. 참고 GFP는 피부 세포가 아닌 주변 keratinocytes에서 구체적으로 표현된다. 스케일 바는 20 μm를 나타냅니다.

이득 또는 손실 기능을 중재 할 lentivirus를 사용하여 머리 소낭 재생 모델의 조직 별 분석.

상피 유래 각질형성세포와 그 하부 중간엽 사이의 상호작용을 필요로 하는 복잡한 과정인 모낭 형태 형성(Hair follicle morphogenesis)은 ...

본 절차의 전반적인 목표는 모낭 형성에 핵심적인 신호 전달 경로의 조직 특이적 기능을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 신생 마우스로부터 일차 진피 세포와 표피 세포를 분리함으로써 이루어집니다. 그다음, 일차 세포에 렌티바이러스를 감염시켜 유전자 발현을 변화시킵니다.세 번째 단계는 표피 및 진피 세포군을 누드 마우스의 상처 부위에 고정된 챔버에 결합하는 것입니다. 그 다음 이식편의 모발 성장 여부를 모니터링합니다. 최종적으로, 유전자 조작이 모낭 형성에 미치는 영향을 육안 및 이식 부위의 조직학적 염색을 통해 평가할 수 있습니다.마우스 비강 모델과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 이식 과정이 3주 만에 완료될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 한 조직의 인자가 다른 조직의 신호 전달 및 기능에 어떻게 영향을 미치는지와 같이, 발생 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답할 수 있습니다. 저희는 질식사시킨 마우스를 세척한 후, 모낭 형성 과정에서 세포 접착 분자의 조직 특이적 기능을 분석하고자 했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다.멸균 가위를 사용하여 각 사지와 꼬리를 몸통 기저부에서 절단합니다. 그런 다음 만곡 핀셋으로 몸통을 단단히 잡고, 메스를 사용하여 머리부터 꼬리까지 등쪽 피부를 따라 절개합니다. 이때 하부의 근막을 뚫지 않도록 주의하십시오.이제 마우스의 정중선으로부터 피부를 조심스럽게 벗겨냅니다. 곡선 핀셋의 긴 면으로 노출된 마우스를 단단히 잡고, 또 다른 곡선 핀셋 한 쌍을 마우스 후단의 피부 아래로 삽입합니다. 이제 한 번의 매끄러운 동작으로 마우스에서 피부를 완전히 벗겨낸 후 사체를 폐기합니다.피부의 진피층이 아래로 향하도록 첫 번째 세척액 접시에 넣습니다. 용액 속에서 피부를 펼치고 포셉으로 흔들어 줍니다. 그다지 피부를 세척액에 둔 상태에서 다음 피부를 해부합니다.다음으로 해부한 피부를 첫 번째 세척액 접시에 넣은 후, 이전의 피부를 두 번째 세척액 접시로 옮깁니다. 모든 피부가 수집될 때까지 두 번째 세척액에 피부를 유지하십시오. 최종 세척 후, 최대 5개의 피부를 차가운 disbe 용액이 담긴 접시로 옮깁니다.피부 조직의 진피 면이 아래로 향하게 하여 평평하게 펴고, 4°C에서 8~16시간 동안 띄워둡니다. 냉장 보관 중인 접시에서 피부 조직 하나를 새 접시로 옮깁니다. 진피 면이 아래로 향하게 하여 평평하게 폅니다.포셉으로 표피를 잡고 진피로부터 천천히 벗겨냅니다. 표피는 하얗고 얇으며 한 조각으로 벗겨져야 하며, 진피는 갈색을 띠고 더 두꺼우며 젤라틴질이어야 합니다. 세포 분리를 시작하기 위해 두 조직을 각각 별도의 배양 접시에 나누어 담습니다.피부 세포를 분리하려면 두 개의 메스를 사용하여 진피를 매우 작은 조각으로 다집니다. 잘게 다진 진피 조직을 갓 제조한 collagenase 용액과 함께 37°C에서 1시간 동안 배양하며, 10분마다 세포 혼합물을 부드럽게 흔들어 줍니다. 소화 과정이 완료되면 다음 단계로 진행합니다.현탁액은 대부분 단일 세포 상태여야 하며, 용액의 색상은 투명한 상태에서 탁한 상태로 변해 있어야 합니다. 이제 세포 현탁액에 10% 부피의 FBS를 첨가하십시오. 이를 70 micron 세포 스트레이너를 통해 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.튜브당 최대 30 mL의 통과액(flow through)을 수집하십시오. 작성된 프로토콜에 따라 피부 세포 분리를 계속 진행하십시오. 각질형성세포를 분리하려면 각 표피를 6~8개의 작은 조각으로 자르십시오.슬라이스된 조직을 갓 해동한 0.05% trypsin EDTA와 함께 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 작성된 프로토콜에 따라 각질 형성 세포 분리를 계속하며, 케타민과 자일라진 또는 선호하는 방법을 사용하여 7~12주령의 암컷 누드 마우스를 마취합니다. 반드시 안구 윤활제를 도포하고 마우스를 가열 패드 위에 놓으십시오.이제 요오드로 등 피부를 소독한 후, 알코올 솜으로 닦아냅니다. 포셉을 사용하여 목 기저부의 피부를 집어 올린 뒤, 집어 올린 피부에 직경 1 cm의 구멍을 냅니다. 상처 부위에 챔버를 배치하고 챔버의 가장자리를 주변 피부로 덮습니다.약 6개의 봉합사를 사용하여 챔버의 가장자리를 고정하십시오. 마우스 한 마리당 하나의 챔버만 부착하십시오. 챔버가 고정되면 세포 현탁액을 확인하십시오. 바닥에 응집되어 있다면 1 mL 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 재부유시키십시오.이제 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이치듯 섞은 후, 1 mL 주사기에 장착된 23 gauge 바늘로 흡입합니다. 바늘로 각 챔버를 찌르고 PBS에 현탁된 세포를 상처 부위에 천천히 떨어뜨립니다. 생쥐가 마취에서 회복되면, 케이지당 두 마리씩 깨끗한 오토클레이브 멸균 케이지에 넣습니다.항생제와 타이레놀을 음용수를 통해 투여하십시오. 7~9일 후, 이전과 동일한 방법으로 처리된 누드 마우스를 마취합니다. 챔버 주변의 피부를 요오드로 소독하고 알코올 솜으로 깨끗이 닦아냅니다.봉합사를 조심스럽게 잘라내어 챔버에서 제거합니다. 새 피부가 챔버에 달라붙어 있는 경우 챔버를 부드럽게 떼어냅니다. 이식편을 챔버에서 조심스럽게 분리합니다.포셉을 사용하여 이식편을 고정합니다. 챔버를 제거할 때, 이식편은 광택이 없고 불투명하게 보여야 합니다. 개방된 상처 부위에 항생제 박막이 도포된 비고착성 패드를 부착하고 두 바늘의 봉합사로 고정합니다.패드를 고정하고 상처를 보호하기 위해 마우스의 몸에 붕대를 감습니다. 붕대가 움직이지 않도록 봉합합니다. 3일 후, 붕대와 패드를 제거합니다. 이 단계에서는 마우스를 마취할 필요가 없습니다.이식편은 건조하고 불투명한 갈색을 띠어야 합니다. 이식 16일 후부터 나타나기 시작하는 모발 성장을 주기적으로 확인하십시오. sonic hedgehog 신호 전달의 핵심 구성 요소인 smoothened 유전자의 진피 특이적 넉다운(knockdown)이 분리된 진피 세포에서 수행되었습니다.이 세포들을 설명된 프로토콜에 따라 모발 재구성 이식편에 적용하였습니다. 3주간의 성장 후, 렌티바이러스 벡터만 처리한 양성 대조군 이식편에서는 강한 모발 성장이 나타났습니다. 하지만 smoothened 유전자의 넉다운은 모발 성장의 심각한 감소를 초래하였습니다.일차 진피 세포 또는 각질 형성 세포 중 하나를 제외한 음성 대조군 이식에서는 털이 전혀 없는 상태로 상처 부위가 회복되었습니다. 마찬가지로, 이식편 내의 특정 세포 유형에서 세포 사멸 또는 세포 소실이 일어난 경우에도 모발 성장이 나타나지 않았습니다. 렌티바이러스 벡터는 이식 실험 전에 우수한 감염 효율을 가진 것으로 확인되었으며, Smoothened, S-H-R-N-A와 함께 GFP를 생성하도록 설계되었습니다.따라서 형광 광학 장치로 모낭의 모유두를 관찰하는 것은 렌티바이러스 발현의 지속성을 확인하는 유용한 대조군이 되었습니다. 3주 후, H&amp;E 염색을 통해 대조군 이식편 내 모낭의 성장 단계와 smoothened 발현이 넉다운되었을 때 나타나는 발달 단계의 지연을 묘사하였습니다. 숙달되면, 이 기술은 적절히 수행될 경우 3일 동안 총 14시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 기술은 암 생물학 분야에서 암 진행 중 종양과 기질 사이의 관계를 탐구하는 데로 확장하여 적용될 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 모낭 형성 과정에서 유전자 기능을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 기존의 유전적 녹아웃(knockout) 방식의 대안으로 당사의 신속 재구성 모발 분석법을 활용해 보십시오.

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 craniofacial 개발 중에 신호 및 표면 두부 ectoderm의 patterning 속성을 테스트하도록 설계되었습니다 조직 이식 기술을 설명합니다.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

간단한 방법은 세포 유형의 다양한 중간 엽 전이 (EMT)에 상피의 유도에 대해 설명한다. 면역 세포에 의한 EMT 상태에있는 세포의 분석 방법이 포함되어 있습니다.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

이러한 모낭과 신경 엔딩으로 - - 공간 조직의 독특한 패턴을 전시 포유류의 피부 구조의 다양한 배열을 포함합니다. 플랫 마운트로 피부를 분석하는 것은 피부 구조의 전체 두께의 고해상도 이미지를 생성하기 위해이 조직의 2 차원 적 형상을 이용한다.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

성체 줄기세포 생물학을 연구하기 위한 이상적인 모델은 쥐의 모낭입니다. 여기에서는 모낭, 줄기세포 및 표피 각질세포의 다양한 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시하며, 쥐 등쪽 피부의 효소 분해와 FACS 분석을 사용합니다.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

우리는 여기에서 마이크로 RNA-200의 가족과 같은 grainyhead 2 (GRHL2)의 결합에 기초 이소성 발현 육종 세포에서 중간 엽 상피 전환 (MET)을 유도하는 세포 배양 방법을 제시한다. 이 방법은 암의 공격성과 치료에 대한 표현형 가소성의 생물학적 영향을 이해하기 더 적합합니다.

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

우리는 이 신호 통로에 관련시킨 단백질 및 유전자 발현을 공부해서 TGF β 신호 및 TGF-β 유도한 EMT를 조사하기 위하여 체계적인 워크플로우를 기술합니다. 방법은 서양 블로팅, 루시파라제 기자 분석, qPCR 및 면역 불피스테인링을 포함한다.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

치과 여포에는 상피 인구와 중간 엽 세포가 포함되어 있습니다. 상피 인구는 뚜렷한 배양 배지를 제공함으로써 이질적인 치과 여포 세포 집단으로부터 선택되었다. 상피 세포는 혈청이없는 배지에서 생존하고 식민지를 형성했다.

인간 치과 여포에서 상피 세포의 격리

배우세요 신생아 마우스에서 분리한 진피와 표피 세포를 이용한 유전자 조작 기법으로 모낭 재생에서 상피-중간엽 시그널링을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 3주 만에 유전자 기능을 평가할 수 있습니다.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

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