헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

이 절차의 전반적인 목표는 모낭 형성에 중요한 신호 전달 경로의 조직 특이적 기능을 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 신생아 마우스에서 1차 진피 및 표피 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, 1차 세포를 렌티바이러스로 감염시켜 유전자 발현을 변경합니다.

세 번째 단계는 표피 세포 집단과 진피 세포 집단을 벌거벗은 쥐의 상처 침대에 고정된 방으로 결합하는 것입니다. 그런 다음 이식편에서 모발 성장을 모니터링합니다. 궁극적으로, 모낭 형성에 대한 유전자 조작의 효과는 시각적으로 그리고 이식 부위의 조직학적 염색을 통해 평가할 수 있습니다.

생쥐 비강 모델과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이식편을 3주 안에 완료할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 한 조직의 요인이 다른 조직의 신호 전달 및 기능에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지와 같은 발생 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 우리는 질식으로 안락사된 마우스를 씻은 후 모낭 형성에서 천장 분자의 조직 특정 기능을 해부하고 싶었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

멸균 가위로 몸통 바닥의 각 팔다리와 꼬리를 잘라냅니다. 그런 다음 한 쌍의 구부러진 집게 사이로 몸을 단단히 잡고 메스를 사용하여 머리에서 꼬리까지 등 피부를 따라 절개합니다. 밑에 있는 근막을 관통하지 마십시오.

이제 마우스의 정중선에서 피부를 조심스럽게 벗겨냅니다. 구부러진 집게의 긴 쪽으로 노출된 마우스를 단단히 잡고 마우스 뒤쪽 끝의 피부 아래에 다른 한 쌍의 구부러진 집게를 삽입합니다. 이제 한 번의 부드러운 동작으로 마우스의 피부를 조심스럽게 완전히 벗겨내고 사체를 버립니다.

첫 번째 세척 용액에 진피 면이 아래로 향하게 하여 피부를 놓습니다. 용액에 피부를 펴고 집게로 저어줍니다. 그런 다음 다음 피부를 절개하면서 세척 용액에 피부를 그대로 두십시오.

다음 절개 된 피부를 첫 번째 세척 용액 접시에 넣은 후, 이전 피부를 두 번째 세척 용액 접시에 옮깁니다. 모든 스킨이 수집될 때까지 두 번째 세척 용액에 스킨을 보관하십시오. 최종 세척 후 최대 5개의 스킨을 차가운 디스베 용액이 들어 있는 접시에 옮깁니다.

껍질 더모 쪽을 아래로 향하게 하여 평평하게 펴고 섭씨 4도에서 8-16시간 동안 뜨게 합니다. 차가운 디스 베이에서 하나의 피부를 새 요리로 옮깁니다. 진피 쪽이 아래로 향하게 하여 평평하게 합니다.

집게로 표피를 잡고 진피에서 천천히 벗겨냅니다. 표피는 한 조각으로 벗겨져야 하며 하얗고 얇아야 하며 진피는 갈색을 띠고 두껍고 젤라틴이어야 합니다. 두 조직을 별도의 배양 접시로 분류하여 세포 분리를 시작합니다.

진피 세포를 분리하려면 진피를 아주 작은 조각으로 다지십시오. 메스 두 개로. 다진 피부 조직을 갓 만든 콜라겐 분해 효소 용액으로 배양하십시오.섭씨 37도에서 10 분마다 한 시간, 소화가 완료되면 세포 혼합물을 부드럽게 교반하십시오.

현탁액은 대부분 단일 세포여야 하며 용액은 맑은 상태에서 흐린 상태로 변경되어야 합니다. 이제 세포 현탁액에 10%부피의 FBS를 추가합니다. 70미크론 셀을 통과시키고 50ml 튜브에 여과합니다.

튜브당 최대 30ml의 흐름을 수집할 수 있습니다. 서면 프로토콜에 따라 진피 세포 격리를 계속합니다. 각질 세포를 분리하기 위해 각 표피를 6-8개의 작은 조각으로 자릅니다.

얇게 썬 조직을 갓 해동한 0.05% tripsin EDTA로 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 서면 프로토콜에 따라 각질 세포 분리를 계속하고 케타민과 자일라진 또는 선호하는 방법을 사용하여 7-12주 된 암컷 누드 마우스를 마취합니다. 눈 윤활제를 바르고 마우스를 발열 패드 위에 올려 놓으십시오.

이제 요오드로 뒷피부를 소독한 다음 알코올 면봉으로 소독합니다. 집게를 사용하여 목 밑의 피부를 꼬집고 꼬집은 피부에 직경 1cm의 구멍을 뚫습니다. 챔버를 상처 부위에 놓고 챔버의 가장자리를 주변 피부로 덮습니다.

약 6개의 봉합사로 챔버를 고정하고 가장자리를 따라 마우스당 하나의 챔버만 부착합니다. 챔버가 고정되면 세포 슬러리를 확인합니다. 바닥에 응축되어 있으면 1 밀리리터 피펫 팁으로 부드럽게 다시 매달아 놓습니다.

이제 세포 슬러리를 부드럽게 휘젓고 1밀리리터 주사기에 부착된 23게이지 바늘로 당깁니다. 바늘로 각 챔버에 구멍을 뚫고 PBS 부유 세포를 상처에 천천히 떨어뜨립니다. 생쥐가 마취에서 회복되면 케이지당 2마리의 생쥐가 있는 깨끗한 오토클레이브 케이지에 넣습니다.

항생제와 타이레놀을 식수를 통해 전달해야 합니다. 7-9일 후, 이전과 같이 처리된 누드 마우스를 마취합니다. 챔버 주변의 피부를 요오드로 소독하고 알코올 면봉으로 청소합니다.

조심스럽게 바늘을 잘라 챔버에서 제거하십시오. 새 피부가 챔버에 달라붙으면 챔버를 부드럽게 제거합니다. 챔버에서 이식편을 부드럽게 분리합니다.

집게를 사용하여 이식편을 아래로 잡습니다. 챔버를 제거하는 동안 이식편은 둔하고 불투명하게 보여야 합니다. 열린 상처에 항생제의 얇은 필름이 묻은 비접착성 패드를 바르고 두 바늘을 꿰매어 제자리에 봉합합니다.

하고 상처를 보호하기 위해 마우스에 붕대를 감습니다. 붕대를 제자리에 봉합합니다.3일 후 붕대와 패드를 제거합니다. 이 단계에서는 마우스를 마취할 필요가 없습니다.

이식편은 건조하고 불투명하거나 갈색이어야 합니다. 이식편에 모발 성장이 있는지 주기적으로 확인하며, 이식 후 16일 후에 나타나기 시작해야 합니다. 중요한 음파 고슴도치 신호 구성 요소인 평활화된 유전자의 피부 특이적 녹다운(dermal specific knockdown)이 고립된 피부 세포에서 이루어졌습니다.

이 세포는 설명된 프로토콜을 사용하여 모발 재구성 이식편에 적용되었습니다. 3주간의 성장 후, 렌티바이러스 벡터를 단독으로 사용한 양성 대조군 이식편은 강력한 모발 성장을 보여주었습니다. 그러나 매끄럽게 된 유전자 녹다운은 모발 성장을 심각하게 감소시키는 결과를 낳았습니다.

일차 진피 세포나 각질 세포를 생략한 음성 대조군 이식편은 털이 없는 상처 부위를 회복하는 결과를 낳았습니다. 마찬가지로, 이식편에 있는 세포 유형 중 하나에 의한 세포 사멸 또는 세포 손실도 모발 성장을 초래하지 않았습니다. 렌티바이러스 벡터는 이식 실험 전에 우수한 감염 효율을 갖는 것으로 확인되었으며, 이 Smoothened, S-H-R-N-A와 함께 GFP를 생성하도록 설계되었습니다.

따라서 형광 광학 하에서 모낭의 진피 유두를 보는 것은 렌티바이러스 발현의 지속 기간을 확인하는 데 유용한 대조군이 되었습니다.3주 후, 대조군 이식편에서 모낭의 성장 단계와 평활화된 발현이 무너졌을 때 지연된 발달 단계를 묘사하기 위해 H 및 d 염색을 사용합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3일 동안 14시간 만에 수행할 수 있습니다. 이 기술은 암 생물학 분야에서 암 진행 중 종양과 기질 사이의 관계를 탐구하기 위해 확장될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 모낭 형성에서 유전자 기능을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 당사의 신속한 재구성 모발 분석을 기존의 유전자 녹아웃에 대한 대안으로 사용하십시오.