곤충 갤러리아 mellonella 세균 Pathogenesis를 조사 할 수있는 강력한 감염 모델로

본 절차의 전반적인 목적은 곤충 유충인 Galleria melanoma에 병원성 박테리아를 감염시키는 것입니다. 이를 위해 곤충 유충을 적절한 성장 단계까지 배양하고 박테리아 용액을 준비합니다. 그 후 혈강 내 주입 또는 강제 급여 방식을 통해 유충에 박테리아를 감염시킨 다음, 48시간 동안 유충의 사망률을 모니터링합니다.

결과 데이터의 분석을 통해 곤충 감염 모델에서의 세균 병원성을 설명합니다. 곤충은 고급 항균 방어 체계를 갖추고 있으며, 특히 복잡한 선천성 면역 체계를 보유하고 있다는 장점이 있어 포유류 모델 사용 시 발생할 수 있는 비용 및 윤리적 문제를 피할 수 있습니다. 따라서 곤충은 포유류 감염 연구를 위한 훌륭한 대체 모델이 됩니다.

본 연구에서는 상대적으로 크기가 크고 15도에서 37도 이상의 온도 범위에서 감염 연구에 활용 가능한 큰납작누에(greater wax moth, *Galleria mellonella*) 유충을 사용합니다. 포유류 환경을 모사하기 위해, Carina NI가 사육 절차를 시연하고 Elizabeth GME와 Christophe Beon이 감염 프로토콜을 시연할 것입니다. 알에서 5령 유충까지의 전체 주기는 약 5주가 소요됩니다.

25°C에서는 성체 나비를 얻기 위해 1~2주일이 더 필요합니다. 수컷 나비의 크기는 10~15mm입니다. 성체 수컷 나방은 베이지색이며 옅은 밝은색과 어두운색의 무늬가 있습니다.

암컷 나비의 크기는 약 20 millimeters입니다. 암컷은 수컷보다 색이 더 어두우며 갈색에서 회색을 띱니다. 최소 100마리의 번데기 또는 갓 우화한 성체 melanoma 나비를 준비합니다. 5 liter 크기의 와이어 메시 케이지 내에 알을 낳을 수 있도록 4겹의 종이 팩 두 개를 매달아 둡니다.

이틀 후, 성체 암컷은 일주일에 두 번 종이 사이의 가장자리에 알을 낳을 것입니다. 알이 낳인 종이 팩을 공기가 순환될 수 있도록 격자가 있는 새로운 플라스틱 사육 상자에 넣으십시오. 상자에는 먹이원으로 화분과 밀랍이 포함되어야 합니다.

알은 약 3일 후에 부화하며, 작은 유충들은 유충당 적절한 먹이 비율을 제공하기 위해 왁스와 화분을 섭취하며 발달하기 시작합니다. 정기적으로 유충들을 새 상자로 분리하고 2일마다 먹이를 보충해 줍니다. 유충은 6단계의 유충 시기를 거쳐 사육됩니다.

각 령(stadium)은 유충 머리 캡슐의 탈피로 구분됩니다. 유충이 번데기가 되기 전 마지막 단계에 도달하면 섭식을 중단하고 보호용 고치 내부에 얇은 실크 고치를 짓기 시작합니다. 이후 유충은 휴면 상태로 들어가 pupy.Wax로 변태합니다.

애벌레는 번데기 단계에서 1~2주 동안 머무른 후 성체 나방으로 우화합니다. 성체 나방은 물을 마시거나 먹이를 먹지 않습니다. 짝짓기가 이루어지면 왁스웜의 생애 주기가 다시 시작됩니다.

병리 분석법을 표준화하기 위해, 유충의 마지막 령(stage)에서 유충을 채집하십시오. 이 단계에서 유충은 섭식을 중단하고 사육 상자의 덮개 쪽으로 이동하며 실을 생산하기 시작합니다. 이 단계는 약 5일 동안 지속되며, 그 이후 유충의 크기가 줄어들기 시작합니다.

고치가 두꺼워지며 유충이 결정을 형성합니다. 유충 단계 중 언제라도 초기 실크 고치를 제거하십시오. 감염 24시간 전에 길이가 2~3 cm이고 무게가 180~250 mg인 종령 유충을 선택하여 빈 상자에 넣어 굶기십시오.

Priscilla, 세균 또는 포자 현탁액은 동봉된 문서에 기술된 대로 mL당 10⁴ CFU에서 10⁸ CFU 범위의 최종 농도로 준비합니다. 각 유충에 원하는 농도의 현탁액 10 µL를 접종합니다. Cry1C 독소 배양액 B를 준비하려면, Cry1C를 인코딩하는 유전자가 포함된 플라스미드 pHTF31C가 형질전환된 CI 균주 407을 10 mg/mL의 erythromycin이 포함된 100 mL HCT 배지에서 30 °C로 72시간 동안 배양합니다. 이를 통해 배양 상층액에서 완전한 포자 형성, 독소 결정 생성 및 방출이 이루어집니다.

박테리아 배양액에서 결정을 정제하기 위해, 40 milliliter 튜브에 sucrose 기울기를 준비합니다. 먼저 79% sucrose 17 milliliters를 넣습니다. 그 다음 79% sucrose 위에 72% sucrose 17 milliliters를 조심스럽게 층으로 쌓습니다.

마지막으로, 10 X 농축 포자 형성 배양액 5~6 mL를 층으로 쌓고 튜브를 닫은 후, 결정과 포자를 분리하기 위해 4 °C에서 20,000 ×g로 14시간 동안 원심분리합니다. 독소 결정은 밀도 구배 계면에 가라앉고, 밀도가 높은 포자는 튜브 바닥에 도달하게 됩니다. 피펫을 사용하여 결정을 수집한 다음, 20,000 ×g에서 다시 원심분리합니다.

G. 원심분리 후, 결정 팔레트를 25 milliliters의 차가운 멸균수에 재부유시켜 세척한 다음 8,000 ×g에서 원심분리합니다. 결정에 달라붙은 모든 sucrose를 제거하기 위해 이 단계를 3회 반복합니다. 결정을 분리한 후, 결정을 5 milliliters의 멸균수에 재부유시키고 현미경으로 관찰합니다. 순도를 평가하기 위해, 50 millimolar 수산화나트륨(sodium hydroxide)으로 사전 가용화한 결정 용액을 대상으로 전통적인 Bradford 염색법을 통해 독소 단백질 농도를 측정합니다.

독소는 사용 전 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 다음으로, 곤충에 박테리아 용액을 주입합니다. 각 조건마다 1 mL 피하 주사기에 물 또는 박테리아 용액 300 µL를 채워 유충 20~25마리를 감염시킵니다.

주사기를 조심스럽게 톡톡 쳐서 기포를 제거합니다. 그 다음 0.45 by 12 millimeter 바늘을 주사기에 장착합니다. 주사기를 자동 주사기 펌프에 장착하고 토출 속도는 1 µL/s, 토출량은 10 µL로 설정합니다.

주입량을 제어하기 위해 빈 튜브에 10 µL의 공시험 주입을 수행합니다. 곤충을 엄지와 검지 사이에 놓고 수동으로 고정합니다. 그런 다음 인젝터에 고정된 바늘을 마지막 다리 기저부의 유충 피부 또는 큐티클에 삽입하고, 박테리아 용액 10 µL를 주입합니다.

바늘에서 곤충을 조심스럽게 제거합니다. 감염된 곤충을 5 cm 페트리 접시에 넣습니다. 접시당 5마리의 유충을 넣고, 각 실험 조건당 최소 20마리의 유충을 감염시킨 후, 접시를 37 °C 인큐베이터에 보관합니다.

본 비디오 섹션에서 2 mL 펜도르 튜브(fendor tube)를 사용하여 시연하는 바와 같이, 곤충을 경구 감염시킬 수도 있습니다. 0.2 µg/µL의 Cry1C 독소를 포자 또는 영양 세포 현탁액과 혼합하여 10 µL당 3 × 10³에서 1 × 10⁶ 사이의 최종 농도를 맞춥니다. 30 gauge 25 mm 피하 주사바늘이 장착된 1 mL 시린지에 박테리아 Cry1C 독소 용액 300 µL를 채워 유충 20~25마리를 감염시킵니다.

주사기에서 기포를 수동으로 제거하고, 곤충의 입이 인젝터에 고정된 바늘에 들어가도록 배치한 후 세균 용액 10 µL를 강제 투여합니다. 구강 주사 후 자동 주사 펌프를 사용하면 용액이 곤충의 장내로 퍼지게 됩니다. 본 예시에서는 10 µL의 청색 염료 용액을 도입하였습니다.

염료가 곤충 유충의 장관 내강을 빠르게 채우는 것을 확인하십시오. 곤충이 용액을 섭취한 후, 5cm 크기의 작은 페트리 접시에 넣으십시오. 각 실험 조건당 최소 20마리의 유충을 감염시키고, 강제 섭식 또는 주입 실험 후 각 접시에 유충 5마리씩을 배치하십시오. 유충을 먹이 없이 25°C 또는 37°C의 페트리 접시에 보관하며, 유충의 폐사 여부를 정기적으로 확인하십시오. 48시간 동안 폐사한 유충은 갈색에서 검은색으로 변하며 움직임이 없습니다.

실험이 종료되면, 생존해 있는 모든 유충을 오토클레이브 가능 백에 넣어 -20 °C에서 24시간 동안 냉동시킨 후, 오토클레이브로 멸균하여 모든 박테리아를 사멸시킵니다. log prob bit 소프트웨어나 유사한 소프트웨어를 사용하여 사망률 데이터를 분석하십시오. 이 프로그램은 용량-사망 곡선의 선형성을 테스트하고 치사량을 제공합니다.

g Melan에 대한 박테리아의 LD 50 혈내 주입법은 여러 인간 병원균의 조직 손상 및 선천 면역 인자에 대한 저항성과 관련된 많은 독성 인자를 식별하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 잠재적인 박테리아 세포벽 펩티다제 C-W-P-F-M이 독성 및 곤충 사망률에 미치는 역할을 결정하기 위해, 여기에서 보여주는 바와 같이 야생형 및 변이주 BOUs 박테리아의 다양한 용량을 투여한 후 곤충 사망률을 평가하였습니다. 곤충 사망률은 용량 의존적이었으나, 유충에 변이 CWP fm 박테리아를 투여했을 때 유의하게 감소하였습니다. 따라서, 이 세포벽 펩티다제는 곤충 유충에 대한 priscilla의 심각한 독성 과정에서 중요한 역할을 합니다. bether 포자가 cryo one C 독소의 살충 활성에 미치는 시너지 효과를 입증하기 위해, bether 야생형 균주의 포자에 cryo one c 결정을 추가하여 Galleria에게 먹였습니다.

결정체가 없는 Melanoma beys를 대조군으로 사용하였습니다. 25°C에서 48시간 후, 이 그래프에 나타난 바와 같이 유충의 폐사율을 평가하였으며, 포자-독소 혼합물을 섭취한 후의 폐사율은 cryo one C 독소 또는 포자만을 단독으로 섭취한 후의 폐사율보다 유의하게 증가하였습니다. 이는 포자 또는 영양 세포가 cryo one C 독소의 살충 활성에 시너지 효과를 준다는 것을 입증합니다.

Galleria mellonella에서 cryo one C의 역할은 박테리아가 파라아트로픽 매트릭스(para atrophic matrix)를 통과하도록 돕는 것입니다. 이 구조는 키틴과 점액이 풍부하여 곤충의 장이 음식물 및 병원균과 직접 접촉하는 것을 방지합니다. 여러 병원균의 감염 모델로서 곤충, 특히 유충 단계를 사용하는 것이 점점 더 일반화되고 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 혈강 및 경구 감염을 수행하는 방법과 Galleria mellonella의 곤충 사망률을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

이러한 방법들은 bombex, ma, spotter 종과 같이 게놈 서열이 분석된 다른 모델 시스템에도 쉽게 적용할 수 있으며, RNA 방법이나 다른 유전자 조작을 통해 숙주를 억제할 수 있습니다.