March 29th, 2013
개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한 프로토콜 Drosophila oocytes가 설명되어 있습니다.
이 프로토콜에서는 GFP 태그가 지정된 단백질을 발현하는 세포를 여성 초파리에서 해부하고 이미지화하여 살아있는 세포에서 단백질의 움직임을 연구합니다. 먼저, 채널을 형성하기 위해 실리콘 그리스를 사용하여 슬라이드에 두 개의 커버 슬립을 부착하여 관찰 챔버를 준비합니다. 채널의 측면에는 헤일로 카본 오일이 늘어서 있습니다.
다음으로, 암컷의 난소를 커버 슬립에 있는 헤일로 카본 오일 한 방울로 절개합니다. 그런 다음 개별 cyte를 분리하고 준비된 슬라이드의 채널 위로 커버 슬립을 반전시켜 view챔버를 만듭니다. 명시야 또는 DIC 광학 장치로 세포를 찾은 후 컨포칼 현미경 및 관련 소프트웨어를 사용하여 설정된 시간 간격으로 디지털 이미지를 캡처합니다.
궁극적으로, 생성된 이미지의 타임 랩스 시퀀스는 시간이 지남에 따라 살아있는 세포에서 단백질이나 입자의 움직임을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 단백질 및 mRNA 수송, 세포 극성 확립과 같은 세포 및 발달 생물학의 주요 영역을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 생후 1주일 미만인 건강한 파리를 마취하고 둥근 크림색 복부를 가진 10-15마리의 큰 암컷을 선택합니다.
선택한 파리와 수컷 몇 마리를 가볍게 효모가 함유된 새 먹이가 들어 있는 바이알에 옮깁니다. 그런 다음 파리를 섭씨 25도에서 이틀 동안 부화시켜 살찌게 합니다. 파리를 살찌우는 것은 다양한 단계, 특히 8단계부터 12단계까지가 살찌지 않은 파리 또는 비참한 파리를 이미징하는 데 사용할 수 있도록 합니다.
표준 유리 슬라이드에 약 1cm 간격으로 두 개의 커버 슬립을 부착합니다. 커버 슬립과 슬라이드 사이를 잘 밀봉할 수 있을 만큼의 그리스만 사용하십시오. 각 커버 슬립을 단단히 눌러 그리스를 얇고 고르게 펴 바릅니다.
그런 다음 덮개가 미끄러지고 미끄러지는 사이의 접합부에 할로우 카본 오일 27을 추가하여 후속 단계에서 고립된 낭세포의 손상을 방지합니다. 이제 22제곱밀리미터 커버 슬립의 표면에 2-3방울의 탄소 오일 27을 떨어뜨립니다. 다음으로 식품 바이알에서 개별 암컷을 입으로 피펫하고 헤일로 카론 오일에 부드럽게 침전합니다.
날카로운 해부 집게를 사용하여 플라이를 커버 슬립에 고정하고 복부 끝을 잡아당깁니다. 커버 슬립 표면을 따라 난소를 드래그하여 난소를 제거하고 오일 아래의 슬립을 통해 커버 슬립에 대한 세포의 접착을 촉진합니다. 이제 난소를 부드럽게 떼어내어 난소 형성의 10 B 단계 이상인 세포를 찾습니다.
이 단계에서 난모세포가 난실 전체 부피의 최소 50-60%를 차지하는 난자를 찾아 난모세포를 식별합니다. 겸자 사용. 1-3명의 암컷을 사용하여 난소초에서 개별 난모세포를 제거합니다.
커버 슬립에서 손상되지 않은 5-8개의 난모세포를 계속 분리합니다. 그런 다음 사용할 수 없는 조직을 제거하십시오. 난모세포가 포함된 커버 슬립을 미리 준비된 슬라이드에 조심스럽게 뒤집어 세포가 두 스페이서 사이에 위치하도록 합니다.
그리고 필요한 경우 cyte를 손상시킬 수 있으므로 커버 슬립을 누르지 말고 샌드위치 가장자리에 소량의 헤일로 카본 오일을 추가하여 공간이 채워지도록 합니다. 난자형성의 이 시점에서 난모세포 위에 있는 난포세포는 더 단단해져서 간호사 세포에 대한 연결이 남아 있는 작은 영역을 제외하고 모든 면에서 난모세포를 둘러쌉니다. DIC 또는 위상차 광학 장치를 사용하여 난모세포에 초점을 맞춥니다.
세포질의 누출 또는 난포 세포의 팽창과 같은 손상 징후가 있는지 난모세포를 검사합니다. 건강하고 손상되지 않은 것처럼 보이는 난모세포만 이미지화합니다. GFP 라벨링 없이 스트리밍을 직접 모니터링합니다.
스코프의 ZI 범위에서 GFP 표지 단백질에 사용되는 것보다 더 높은 게인 설정으로 캡처 이미지를 설정합니다. 공기 대물렌즈를 사용하여 샘플의 드리프트 및 이동을 크게 최소화합니다. 난모세포 표면 바로 아래에 있는 광학 단면을 얻습니다.
관심 영역에 초점이 맞춰지면 명시야 광학 장치를 끄고 소프트웨어의 빠른 스캔 미리보기 기능을 사용하여 컨포칼 이미징으로 전환하고 필요에 따라 초점과 게인을 조정합니다. 또한 여기(excitation), 파장(wavelength) 및 방출 파장(emission wavelength)에 대한 파라미터를 설정합니다. Z축 캡처의 경우 프레임 사이에 10초의 지연이 있는 상수 Z축을 선택합니다.
20프레임에서 50프레임 사이의 일반적인 타임랩스 시퀀스를 캡처한 후 즉시 비디오 품질을 검토하고 평가합니다. 이 단일 타임랩스 이미지는 11기 난모세포를 보여줍니다. GFP 표지 단백질 R TNL one을 발현하는 이 난모세포는 강력한 신호를 생성할 수 있습니다.
R TNL one은 op plasmic streaming 동안 존재하는 긴 미세소관과 공동 국소화하는 것으로 보입니다. 일반적으로 야생형 난실에서의 op plasmic stream은 10 B 단계 난실의 5프레임 최대 투영에서 볼 수 있듯이 자가형광 ylk 소포의 눈에 띄는 움직임으로 분명합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 GFP 태그가 지정된 단백질을 발현하는 건강한 여성 세포를 분리하는 방법, 라이브 이미징을 위한 샘플을 준비하는 방법, 형광 단백질 및 입자의 타임랩스 비디오를 촬영하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 프로토콜은 초파리 난모세포에서 GFP 태그가 붙은 단백질의 생체 영상을 촬영하는 방법을 설명합니다. 이는 시야 챔버 준비 및 개별 난모세포의 해부 및 영상 촬영을 포함하여 살아있는 세포에서 단백질의 이동을 연구하기 위한 세부 사항을 설명합니다.
Live imaging of GFP-tagged proteins in Drosophila oocytes enables real-time visualization of protein dynamics, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides predictive confidence for target validation by linking protein behavior to cellular processes such as mRNA trafficking and polarity establishment. The method offers a disease-relevant system for probing cytoskeletal function and organelle organization with translational biomarker potential.
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification by providing quantitative, dynamic readouts of protein behavior in a genetically tractable system.