Name: 환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연 + Putative 암 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 배우세요 환자 유래 흑색종 세포 배양 및 MACS를 이용한 CD133+ 암 줄기 세포 분리 방법입니다. 적혈구와 섬유아세포를 제거하여 고순도 세포 집단을 얻고, 맞춤형 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는이 일을 지원하고 비판적으로 원고를 읽기 위해 교수 M. Dietel와 더크 슈마허 감사드립니다. 이러한 결과로 이어지는 연구 보조금 협정 N 아래의 혁신적인 의약품 사업 공동 인수 ° 115,234, 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)와 EFPIA 회사 &#39;에서의 금전적 인 기부로 구성되는 자원의 지원을받은 친절한 기여. 이 작품은 베를린 Krebsgesellschaft (BKG)에 의해 지원되었다.

기본 세포 배양, 섬유 아세포 고갈과 CD133의 자기 세포 정렬의 종양 조직, 특성의 기본 단일 세포의 준비를 포함하여 실험의 전체 계획은 +와 CD133 - 흑색 증 세포는 그림 1에 표시됩니다. 1. 샘플 취득 <ol><li> 다음 단계를 고려하기 전에 윤리적 승인을 확인합니다. </li><li> 멸균 PBS가 수술 또는 팀 이상 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신 최종 농도와 손으로 보충과 함께 50 ML 튜브를 준비합니다. </li><li> 4 ° C.에서 수술에서 세포 배양 연구소로 종양 조직의 빠른 전송을 구성 </li></ol> 2. 종양 조직에서 기본 흑종 단일 세포를 준비 <ol><li> 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 종양을 절제하기 전에, 하나는 해리 믹스를 준비해야합니다. 2-4g 조직 당 10 ML 해리 혼합이 필요합니다. 믹스는 immedia를 사용할 수 있습니다tely 또는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 10 ML aliquots에 저장됩니다. <ol><li> 150 밀리미터 나트륨 염화물을 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 만약 0.22 μm 필터를 사용하여 필요한 멸균 - 여과 나트륨 염화물 솔루션입니다. </li><li> DNase I을 무게 10 밀리그램 / 150mM 나트륨 염화물에 ML DNase I을 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 버팅으로 섞는다. </li><li> PBS에서 100mg/ml Collagenase IV를 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 버팅으로 섞는다. collagenase 솔루션의 Aliquots은 몇 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 MG / ML Collagenase IV 및 0.1 밀리그램 / 양자 263 매체에서 ML DNase I의 최종 농도로 해리 믹스를 준비합니다. 소용돌이를 사용하여 섞는다. 선택 사항 : 1.5 μg / ML Amphotericin B.의 최종 농도로 분리 믹스로 피부를 추가 Amphotericin B 솔루션에서 파생 흑색 증 세포를 사용하는 경우 </li></ol></li><li> 사전 따뜻한 req37 해리 믹스, PBS 및 양자 263 매체의 uired 양 ° C. </li><li> 멸균 페트리 접시에 장소 종양 조직. 조직에서 과도한 솔루션을 기음 500 μl 분리 믹스를 추가합니다. 신선한, 멸균 메스를 사용하여 2-4밀리미터 작은 조각으로 종양을 이기다. </li><li> 전송 2~4그램 5 ML 해리 혼합을 포함하는 gentleMACS C 관에 종양 조직을 다진. 추가 4.5 ML 분리 믹스로 페트리 접시를 씻어 gentleMACS C 튜브에 남아있는 조직 조각을 추가 할 수 있습니다. </li><li> gentleMACS C 관을 닫고 gentleMACS의 Dissociator의 소매에 거꾸로을 첨부합니다. gentleMACS 프로그램 &quot;h_tumor_01&quot;를 실행합니다. </li><li> dissociator에서 gentleMACS C 관을 분리하고 37 30 분의 샘플을 배양 ° C 정착 조직 조각을 resuspend하기 위해 최선을 5 분 가장 높은 실행 속도 (12 RPM) 또는 수동으로 튜브를 회전하여 MACSmix 튜브 회선 근을 사용하여 연속 회전에 따라 . </li><li> t의 소매에 거꾸로 gentleMACS C 관을 첨부그는 gentleMACS Dissociator하고 gentleMACS 프로그램 &quot;h_tumor_02&quot;를 실행합니다. </li><li> dissociator에서 gentleMACS C 관을 분리하고 37 30 분의 샘플을 배양 ° C 정착 조직 조각을 resuspend하기 위해 최선을 5 분 가장 높은 실행 속도 (12 RPM) 또는 수동으로 튜브를 회전하여 MACSmix 튜브 회선 근을 사용하여 연속 회전에 따라 . </li><li> gentleMACS의 Dissociator의 소매에 거꾸로 gentleMACS C 관을 첨부하여 gentleMACS 프로그램 &quot;h_tumor_03&quot;를 실행합니다. </li><li> dissociator, resuspend 샘플에서 gentleMACS C 관을 분리하고 50 ML 튜브에 위치 70 μm 세포 스트레이너에 세포 현탁액을 적용합니다. 필터의 막힘 것이 발생하면 전체 현탁액을 통해 실행까지 살균 필터 팁과 세포 현탁액을 젓는다. </li><li> 5 ML 양자 263 매체와 셀 스트레이너를 씻어. </li><li> 선택 사항 : 당신은 여전히​​ 양자 263 매체와 적절한 세포 배양 말요에 씨앗을에 필터를 resuspend 조각에 남아있는 조직 조각이있는 경우H. 37 조각을 길러 ° C 5 % CO 2. </li><li> 셀 스트레이너을 취소하고 소화 세포 현탁액으로 50 ML 튜브를 닫습니다. 300 XG에서 5 분에 세포 현탁액을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 선택 사항 : 셀 펠렛 인해 적혈구 500 μl PBS로 두 번 증류수, resuspend 세포 펠렛의 10 배 솔루션 1시 10분을 diluting하여 1X 적혈구 용해 용액을 준비하는 높은 금액으로, 5 ML 1X 적혈구 용해를 추가 빨간색 표시되는 경우 솔루션입니다. 10 분 동안 실온에서 소용돌이 5 초 및 품다. 300 XG에서 5 분 동안 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 양자 263과 씨앗 적절한 세포 배양 플라스크에 세포와 종양 세포를 Resuspend. 37 번 문화 종양 세포 ° C 5 % CO 2가 80 % 합류에 도달 정기적으로 통로 세포. </li></ol> 3. 기본 셀 문화와 섬유 아세포 고갈의 특성 <ol><li> phenotypically microsco를 사용하여 기본 세포 배양를 분석PE. </li><li> 기본 세포 배양의 작은 양 (0.5x 10 6 세포)를 수확하고 neoplastic -, 흑색 증 -, 줄기 세포와 기질 세포 마커 유전자에 대한 프리 머와 RT-PCR을 수행합니다. 분석 할 수있는 가장 중요한 유전자는 CD90 (섬유 아세포 마커), 티르 (흑색 증 / melanocyte 마커), CD133 (암 줄기 세포 마커), CD83 (성숙 수지상 세포 마커) 및 하우스 키핑 유전자 (예 : HPRT 또는 GAPDH)입니다. </li><li> RT-PCR 동안 현미경 분석과 CD90의 높은 표현이 섬유 아세포와 기본 흑색 증 문화의 높은 오염을 공개하는 경우, 당신은 Miltenyi에서 안티 섬유 아세포의 MicroBeads 및 D 열을 사용하여 섬유 아세포를 고갈해야합니다. </li></ol> 4. 자기 세포 CD133의 정렬 +와 CD133 - LS 열을 사용하여 흑종 셀 <ol><li> PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 % FCS를 포함하는 맥 버퍼를 준비합니다. 0.22 μm Steritop-GP 필터 유닛을 사용하여 반전 및 살균 - 여과 버퍼로 섞는다. 4-8 ° C에 칠 버퍼사용하기 전에 및 가스를 제거하다. </li><li> 37 미리 따뜻한 Accutase, PBS 및 양자 263 매체 ° C. </li><li> PBS로 80% 합류 세포를 씻으십시오. Accutase의 적절한 금액을 추가하고 셀 문화 표면에서 분리 될 때까지 알을 품다. 양자 263 매체를 사용하여 50 ML 튜브에 세포를 수집합니다. </li><li> 휴대폰 번호를 결정하고시 5 분에 세포의 필요한 번호 (배 10 9 셀의 최대 수는 LS 칼럼 당로드 할 수 있습니다. 셀 라인을 특정 최적의 번호가 결정되어야하며 상당히 낮을 수 있습니다 Miltenyi의 프로토콜에 따라.) 원심 분리기 300 XG와 4-8 ° C. 완전히 표면에 뜨는 대기음. </li><li> 350 μl 맥 버퍼와 1X 10 8 셀의 최대 (높은 세포 숫자가 따라 모든 다음 맥 버퍼를 확장, FcR 차단 시약, CD133/1-Biotin 및 안티 - 비오틴 MicroBeads은 볼륨 용) Resuspend. </li><li> 100 μl FcR 차단 시약을 추가합니다. </li><li> 50 μl CD133/1-Biotin을 추가합니다. 4-8에서 소용돌이과 품다를 사용하여 잘 혼합 ° C F또는 10 분. </li><li> 300 XG와 4-8 ° C.에서 5 분 10 ML 맥 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으십시오 완전히 표면에 뜨는 대기음. </li><li> 세척 단계 (4.8)을 반복 </li><li> 400 μl 맥 버퍼와 Resuspend 세포 펠릿. </li><li> 100 μl 방지 비오틴 MicroBeads을 추가합니다. 15 분에 4-8 ° C에서 소용돌이과 품다를 사용하여 잘 섞는다. </li><li> 한편, 자기 분리의 맥 구분 기호를 준비합니다. 맥 격리 멀티 스탠드에 QuadroMACS을 첨부합니다. QuadroMACS의 자기장의 전면에 열 날개와 LS 열 필요한 번호를 삽입합니다. 각 항목 아래 각 LS 열 및 적절한 수집 관 (15 ML 50 ML)로 사전 분리 필터 (30 μm 나일론 메쉬 포함) 놓습니다. 3 ML 맥 버퍼와 린스에 의해 필터 항목을 준비합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 300 XG와 4-8 ° C.에서 5 분 10 ML 맥 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으십시오 완전히 표면에 뜨는 대기음. </li><li> 500 μl와 세포를 Resuspend맥 사전 분리 필터와 함께 LS 열에 세포 현탁액을 버퍼와 적용됩니다. </li><li> 열 당 3 ML 맥 버퍼로 세 번 씻으십시오. 열 저장소가 비어있는 경우에만 새로운 버퍼를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 세포 분율 - 수집 된 총 유출은 라벨이 지정되지 않은 CD133이 포함되어 있습니다. </li><li> 사전 분리 필터를 삭제 하시겠습니까, 구분 기호에서 열을 제거하고 적절한 회수 관에 배치. </li><li> 5 ML 맥 버퍼를 적용 할 수 있습니다. 즉시 단단히 열로 플런저를 밀어 레이블 CD133 + 세포를 제거. </li><li> 부정적인 분수의 순도를 높이기 위해 QuadroMACS에 삽입하는 equilibrated LS 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 분수 - 유출은 CD133이 포함되어 있습니다. </li><li> 열을 폐기하십시오. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

종양 세포 펠렛에서 적혈구 contaminations를 제거하기 위해 우리는 매우 Miltenyi에서 적혈구 용해 용액을 사용하는 것이 좋습니다. 기존의 Ficoll 밀도 기울기 원심 분리를 통해 적혈구를 lysing의 장점은 빠르고 간단는 것입니다. 또한, Ficoll 또는 적혈구와 종양 세포의 손실과 contaminations을 피할 수 있습니다. 너무 오래 대기 할 때 일반적으로 종양 세포를 ...보다 빨리 자라다 이후이 기본 세포 배양에서 섬유 아세포의 성장을 관찰 할 때 즉시 제거해야합니다. Miltenyi의 맥 기법으로 세포를 정렬 할 때 우리는 효소 세포를 수확하는 것이 좋습니다. 셀 스크레이퍼를 사용하면 세포와 표면 epitopes에 gentler 될 수 있지만, 맥 컬럼에 nonspecifically 바인딩하고 열을 방해 셀 조각을도를 생성합니다. 기존의 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 치료를 통해 Accutase의 장점은 감소 세포 스트...

피부 악성 melanomas 피부 암의 가장 일반적인, 아직 대부분의 치명적인 유형입니다. 증가 발생, 사망의 1,2을 관련 악성 피부 종양의 75 %를 종과 빠른 보급의 높은 학년, 지금 melanomas 계정으로 인해. 기본 종양, 화학 요법, 방사선 치료, immunotherapy와 metastasized 흑색 증의 결합 화학 및 immunotherapy의 수술 절단 외에 흑색 증 치료 3,4의 최신 전략입니다. 그러나, 악성 흑색 증은 chemotherapeutics에 가난한 응답 (5-12%) 5,6,하고 vemurafenib 7 치료 등 새로운 타겟 치료를 약속에서 BRAF V600E 유전자 변이 혜택을 들고 흑색 증 환자 만 50-70%에 의해 특징입니다 전체 생존을 개선, 흑색 증의 tumorigenesis의 메커니즘을 훨씬 더 이해가 필요합니다. 과거 잘 알려진 commer에 그 메커니즘을 연구하기 위해cially 가능한 셀 라인은 사용되었습니다. 암 개시 및 진행의​​ 분자 이벤트를 공부하는 최근의 접근 방법은 종양 조직에서 직접 파생 된 주요 문화 활용 - 전략 베어링 매니 폴드 혜택을 : 연구원은 환자 및 조직 선택에 대한 모든 권한이 있습니다. 샘플 셀 전문적 선택 종양 조직에서 얻은, 모든 이질성과 종양과 유사하고 후속 환자의 데이터와 자세한 병리는 문화의 특성을 원래의 종양 (8)의 사람들과 비교 할 수 있도록 할 수 있습니다. 반면, 암 연구에 관련 모델 시스템과 같은 설립 세포 라인의 사용은 controversially 설명되어 있습니다. 이미 1987 년에 오스본과 동료는 다른 실험실 9 일부터 MCF-7 인간 유방암 세포 라인 간의 중요한 생물학적 차이를 설명했다. 하위 문화 중 RNA의 발현에있는이 광범위한 게놈의 불안정과 유사 공동했습니다Hiorns 외로 nfirmed.와 셀 라인으로써 인간의 암 (10)의 모델 등의 설립 문화의 직접적인 관련성을 약화, 문화 발전 않는 증거에 대한 지원 데이터를 제공했습니다. 크게 년 동안 무시되었습니다 또 다른 중요한 고려 사항은, 세포 라인의 큰 번호가 헬러에 의해 오염 된 것으로 첫번째 시연에서 20 년 이상 전에 강조했다 무관 &#39;false&#39;로 세포와 문화의 오염이나 전면에 자라 난의 위험이 세포 8,11. &#39;false&#39;로 셀 라인의 데이터 오해는 최근 다시 문학에 불하게되었습니다. DNA 프로파일과 분자 cytogenetics의 조합을 사용하여, MacLeod 외이 있습니다. 252 새로운 종양 파생 인간의 세포 라인, 미생물 및 세포 문화 (DSMZ)의 독일 모음에서 입금 거의 18%이 intraspecies이 발견되거나 교차 interspecies 것으로 밝혀 - 오염 물질 12,13. 이러한 문제를 방지하고 위에서 언급 한 장점을 이용하기 위해, 우리는 신선한 excised metastases에서 낮은 통로 흑색 증 세포 라인을 구축하기로 결정했습니다. 강력한 세포 분리 및 분석 기술은 동시에 독특한 표면 단백질의 세포 죽음과 파괴를 제한하면서 단일 셀 준비가 생성되어야합니다. 단일 셀 중지로 조직의 자동화 분리에 대한 benchtop 악기는 Miltenyi에 의해 제조 gentleMACS의 Dissociator입니다. 항원 epitopes을 보존하고 셀 손실을 줄이면서 gentleMACS C 튜브 및 최적화 된 분리 솔루션 폐쇄 된 시스템에서 종양 조직의 효과적이고 부드러운 해리와 함께 사용하면 달성된다. 악기가 특정 어플리케이션과 guaranties 흑색 증 조직 14 일부터 단일 셀 현탁액의 표준화 준비 다양한 최적화 된 사전 설정 프로그램을 제공합니다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 종양의 대부분이 독점적으로 종양 - 시작 및 용량을 자기 갱신을 전시라는 암 줄기 세포 (CSCs)의 작은 subpopulation을 품다 것으로 밝혀 최근보고합니다. 피부의 진피에 melanocyte - 생산 줄기 세포의 식별은 UVA 방사선에 노출은 악성 변형 15 셀을 수상 할 수 있기 때문에 이러한 세포가 흑색 증의 암 줄기 세포 (CSCs)의 근원이 될 수 있다는 가설을 이끌었다. 이러한 유전자 병변의 결과는 종양과 줄기 세포 특성의 조합을 가지고 있고, 셀 것입니다. 흑색 증에 CSCs의 subpopulation을 표현하기 위해 제안 된 주요 마커 중 하나는 CD133 16-20입니다. CD133 (또한 Prominin 1로 알려져 있음), pentaspan transmembrane의 glycoproteins의 회원은 조혈 줄기 세포, 내피 전구 세포, neuronal 및 glial 줄기 세포 21-23에 표시됩니다. CD133의 표현이과 상관있다비대칭 세포 분열 24, 및 CD133의 glycosylated 에피토프는 세포 분화 25시 downregulated로 표시했습니다. 최근 CD133 + 흑색 증 세포는 자기 갱신과 종양 - 개시 용량 19,20가 게재되었습니다. CD133 + putative 흑색 증 CSCs의 기능을 연구하기 위해, 우리는 수정 및 CD133의 매우 풍부하고 가능한 인구 +와 CD133 얻을 수 Miltenyi 생명 공학에서 자기가 활성화 된 셀 정렬 (맥) 시스템 최적화 - 세포를. Matheu 외하여 그림과 같이 자석 구슬 기반의 세포 분리도 부정적인 선택할 수 있습니다. 26 긍정적 인 선택 우리가 여기에 표시로. 긍정적 인 선택하는 동안 특정 대상 셀 유형, 예를 들어 CD133 표현 세포는 자기 (磁气)에 대한 매우 구체적인 항체에 복합 아르 MicroBeads, 50 나노 미터 superparamagnetic 입자으로 표시됩니다특정 세포 표면 항원. 라벨이없는 세포를 통해 유동 반면 분리하는 동안 자기 (磁 气) 라벨 세포는 분리의 자기장의 항목에서 유지됩니다. 세척 단계 후, 열 구분 기호의 자기장에서 제거되고, 대상 셀은 열에서 용출되어 있습니다. LS 또는 MS 항목은 고순도로 표시하고 라벨이없는 세포의 분수에 긍정적 인 선택 결과 중에 사용됩니다. 한편, 부정적인 선택에 사용되는 LD 열, 레이블 분수의 약간 낮은 순도하는 결과를 가져올 수도 있습니다. 자신의 매트릭스의 포장 밀도로 인해이 항목에 유속은 열에 갇힌 할 레이블이 지정되지 않은 세포의 높은 위험이 낮은 결과로 수 있습니다. LD 열 따라서 원치 않는 세포 subpopulation의 엄격한 고갈 용으로 만 사용되어야합니다. 긍정적 인 선택은 incubatio 다음 MicroBeads와 함께 직접 (MicroBeads에 커플 링 된 항체) 또는 간접적으로 자기 라벨 (부화에 의해 수행 될 수N 차 항체로). 특정 맥의 MicroBeads은 전립선이나 흑색 증 27 등의 주요 종양 세포의 다양한 세포 유형의 긍정적 인 선택하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories의 GmbH의 </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B 솔루션을 250 μg / 탈 이온수에 ML </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> 안티 섬유 아세포의 microbeads </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IV </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Applichem GmbH의 </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> CA, MG없이 D-PBS </td><td> PAA Laboratories의 GmbH의 </td><td> H15-002 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Ethylenediaminetetraacetic 산 나트륨 소금 탈수 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS 수 페리 어 </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> 간접 CD133 마이크로 비드 키트 사람 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-091-895 </td><td> 포함 : CD133 / 1 (AC133) 비오틴, 항 비오틴 MicroBeads 및 FcR 차단 시약 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신, 액체 (100x) </td><td> Invitrogen GmbH의 </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 양자 263 </td><td> PAA Laboratories의 GmbH의 </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> 적혈구 용해 용액 (10 배) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; 셀 스트레이너 (70 μm) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C 튜브 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> 맥 구분 기호 멀티 스탠드 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> 맥 간격 열 25 LS 열 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix 튜브 회전하는 것 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchlo​​ride </td><td> 머크 KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> 사전 분리 필터 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-041-407 </td><td></TD&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS 구분 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo - 주사기 필터 (0.22 μm, PES) </td><td> 칼 로스 GmbH의 앤 컴퍼니 KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP 필터 유닛 500 ML </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

환자 유래 세포 배양 및 cd133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; putative 암 줄기 세포

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

사용 가능한 흑색 증 오늘은 개선 치료 옵션에도 불구하고, 고급 악성 흑색 증 환자는 여전히 진행 무료 및 전반적인 생존 가난한 예후 (豫 后)가 있습니다. 따라서, 병진 연구는 악성 melanomas에 대한 타겟 치료를 개선하기 더 분자 증거를 제공해야합니다. 흑색 증에 관한 과거 종양 발생 메커니즘에 광범위하게 구축 된 세포 라인에서 공부했다. 각각의 유전자 프로파일에 따라 맞춤 치료 regimens로가는 길에, 우리는 환자 파생 세포 라인 대신 일반 세포 라인을 사용하여 제안합니다. 함께 특히 환자 후속에 대한 고품질의 임상 데이터와 함께 이러한 세포는 더 흑색 증의 진행 뒤에 분자 메커니즘을 이해하기 수단이 될 것입니다. 여기, 우리는 해부하는 새로운 종양 조직에서 기본 흑색 증 문화의 설립을 신고합니다. 이 절차는 하나의 셀에 날카과 조직의 분해, 재를 포함적혈구와 섬유 아세포뿐만 아니라 주요 문화와 세포 &#39;흑색 증 원본을 신뢰할 수있는 인증과 contaminations의 moval. 최근 보고서 발표 그 melanomas, 종양의 대부분이 같은 항구 독점적으로 전이성 상태에 대한 종양 개시 및 진행을 연료 것 같습니다 암 줄기 세포 (CSCs)의 작은 subpopulation. 흑색 증의 CSC 식별 및 절연을위한 주요 마커 중 하나는 CD133입니다. 기본 흑색 증의 문화에서 CD133 + CSCs를 분리하기 위해, 우리는 수정과 자기가 활성화 된 셀 높은 정렬 순도의 결과로 Miltenyi에서 정렬 (맥) 절차와 CD133 + CSCs와 CD133의 생존 최적화 - 대량, 재배 및 기능적 분석 할 수 이후.

종양 조직에서 단일 세포의 준비 그림 2 (A)와 (B) 기계 분리 한 후 2~4mm 조각에 전에 늦은 단계 흑색 증 환자의 resected의 림프절 전이의 실천. 70 μm 나일론 메쉬를 통해 조직과 여과의 효소 분해 후, 세포는 pelleted이었고 표면에 뜨는를 삭제했습니다. 이 단계에서 우리는 그림 2C의 셀 펠렛의 붉은 색으로 표시로 적혈구와 높은 오염을 관찰했다. 그 후, 우리는 밝은 갈색 색상 (그림 2D)의 세포 펠렛으로 이어진 붉은 혈액 세포를 고갈. 이러한 세포는 37 resuspended과 양자 263 매체 배양 된 ° C 5 % CO 2. 기본 셀 문화의 특성 세포가 종양에서 발생한 여부를 확인하고하지 기질 주변에서, 우리는 RT-PCR을 수행melano...

이 문서는 기본 셀 문화, 및 종양 세포에서 적혈구와 섬유 아세포의 contaminations를 제거하는 방법에 신선한 얻은 흑색 증 조직의 준비에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 어떻게 묘사 CD133<sup&gt; +</sup&gt; putative 흑색 증의 줄기 세포는 CD133에서 정렬되어<sup&gt; -</sup&gt; 자기 활성화 셀 정렬 (맥)를 사용하여 대량.

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 악성 흑색종으로부터 환자 유래 세포 배양물을 구축하고, CD 133 양성으로 추정되는 암 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 종양 조직으로부터 일차 흑색종 단일 세포를 준비하고, 세포 펠릿에서 적혈구를 제거함으로써 수행됩니다. 필요한 경우, 일차 세포 배양물을 특성화하고 섬유아세포를 제거하십시오.마지막 단계는 CD 1 33 양성 및 CD 1 33 음성 흑색종 세포의 자기 세포 분리를 수행하는 것입니다. 결과적으로, 이 최적화된 MACS 절차는 고도로 농축되고 생존 가능한 CD 1 33 양성 및 CD 1 33 음성 세포 집단을 얻을 수 있는 탁월한 방법입니다. 연구진은 먼저 암 환자의 약물 반응을 예측하고자 하는 맞춤 의학 분야에서 상용화된 세포주를 사용할 수 없는 상황이었으며, 이를 위해 해당 기술을 사용하여 in silico 데이터를 검증하였습니다.이 기술의 주요 장점은 악성 흑색종의 추정 암 줄기세포인 CD 1 33 양성 세포에 빠르게 접근할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 저희 실험실의 실험실 기술자인 Catherine Davis가 설명하겠습니다. 수술을 통해 갓 분리한 종양 조직을 1% penicillin streptomycin이 포함된 멸균 PBS에 넣어 조직 배양 실험실로 옮기십시오.종양 조직을 멸균 페트리 접시에 옮기고 과잉 용액을 흡인합니다. 그 다음 500 µL의 해리 혼합물을 첨가하고, 새로운 멸균 메스를 사용하여 종양을 2~4 mm 크기의 작은 조각으로 잘게 다집니다. 이제 5 mL의 해리 혼합물이 들어 있는 gentle max C tube에 다져진 종양 조직 2~4 g을 옮깁니다.페트리 접시를 4.5 milliliters의 해리 혼합물로 추가로 헹구고, 남은 조직 파편들을 gentle max C 튜브에 넣습니다. 튜브를 닫고 해리 장치의 슬리브에 거꾸로 부착한 후, H tumor zero one 프로그램을 실행합니다. 그다음, 최고 회전 속도로 계속 회전시키며 37 °C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.이제 튜브를 해리 장치의 슬리브에 거꾸로 부착하고 H tumor zero two 프로그램을 실행하십시오. 그 다음 12 RPM의 지속적인 회전 상태에서 37 °C로 30분 동안 샘플을 배양하십시오. 이어서 gentle max 프로그램 H tumor zero three를 실행하십시오.샘플을 재현탁하고 세포 현탁액을 70 micron 세포 스트레이너를 통해 50 milliliter 튜브에 통과시킵니다. 필요한 경우, 현탁액 전체가 통과할 때까지 멸균 필터 팁으로 세포 현탁액을 저어줍니다. 세포 스트레이너를 5 milliliter의 quantum 2 6 3 배지로 헹구고, 세포 현탁액을 300 G에서 5분 동안 원심 분리하여 펠릿을 형성한 후 상층액을 제거합니다.세포 펠렛(pellet)이 많은 양의 조직과 점액으로 인해 붉게 보인다면, 동반된 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 적혈구를 제거하십시오. 종양 세포를 2,630 rpm에서 다시 원심 분리하고 배양 접시에 접종하십시오. 세포가 80% 합류도(confluence)에 도달하면 통상적으로 계대 배양을 수행하십시오. 현미경을 사용하여 일차 세포 배양의 표현형을 분석하십시오.그 다음, cDNA 합성을 위한 RNA 추출을 위해 일차 세포 배양액의 소량을 수확하고, 신생 흑색종, 줄기세포 및 기질 세포 마커 유전자용 프라이머를 사용하여 R-T-P-C-R을 수행합니다. 분석해야 할 가장 중요한 유전자는 섬유아세포 마커인 CD 90, 흑색종 및 멜라닌 세포 마커, 암 줄기세포 마커인 CD 1 33, 성숙한 수지상 세포 마커인 CD 83, 그리고 HPRT 또는 GAAP dh와 같은 하우스키핑 유전자입니다. 현미경 분석과 R-T-P-C-R 분석 결과 일차 흑색종 배양액에서 높은 섬유아세포 오염이 확인되면, 항섬유아세포 마이크로비드와 LD 컬럼을 사용하여 섬유아세포를 제거합니다.80% 밀도로 합류된 세포를 미리 데워둔 PBS로 세척한 후, 적당량의 Accutane을 첨가하고 세포가 배양 표면에서 떨어져 나올 때까지 배양합니다. 세포를 quantum 2 6 3 배지로 수확하여 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 세포 수를 산정한 후, 필요한 수의 세포를 300 G, 4~8 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.상청액을 완전히 흡입하여 제거하고 재현탁합니다. 최대 1×10⁸개의 세포를 350 µL의 max buffer에 현탁한 후, 100 µL의 FCR blocking reagent와 50 µL의 CD 1 33.1 biotin을 첨가합니다.잘 섞은 후 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. 10 mL의 max buffer로 세포를 세척한 다음, 4~8 °C, 300 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 두 번째 세척 후 상층액을 완전히 흡입하여 제거합니다.세포 펠릿을 400 µL의 max buffer에 재현탁합니다. 100 µL의 anti biotin microbeads를 첨가하고 잘 섞은 후 4~8 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그동안 자기 분리를 위해 max separator를 준비하려면, quadro max를 max separator multis stand에 장착하십시오.quadro max의 자기장에 컬럼 윙이 전면을 향하도록 필요한 수의 LS 컬럼을 삽입하십시오. 각 LS 컬럼에 사전 분리 필터와 적절한 수집 튜브를 배치하십시오. 각 컬럼 아래에서 3 mL의 max buffer로 필터와 컬럼을 헹구고 통과액은 버리십시오.앞서 설명한 대로 max buffer로 세포를 세척한 후, 500 µL의 max buffer에 세포를 다시 현탁하고 준비된 LS 컬럼에 세포 현탁액을 도포합니다. 컬럼당 3 mL의 max buffer로 3회 세척합니다. 표지되지 않은 cd 1 33 음성 세포 분획의 전체 유출액을 수집합니다.다음으로, 분리 전 필터를 폐기합니다. 분리기로부터 컬럼을 제거하여 적절한 수집 튜브에 배치합니다. 5 mL의 max buffer를 가합니다.음성 분획의 순도를 높이기 위해 플런저를 컬럼 안으로 강하게 밀어 넣어 표지된 CD 1 33 양성 세포를 즉시 씻어냅니다. 세포 현탁액을 평형화된 새 LS 컬럼에 적용하고 유출되는 CD 1 33 음성 분획을 수집합니다. 이 절제된 림프절 전이는 말기 흑색종 환자로부터 얻은 것입니다.조직을 기계적 및 효소적으로 해리시킨 후, 필터링된 세포 펠렛에는 적혈구 오염이 심하게 나타났습니다. 이어서 적혈구를 제거하자 연한 갈색의 세포 펠렛을 얻을 수 있었습니다. 이 세포들은 quantum 2 6 3 배지에서 배양되었으며, 여기서는 멜라닌 세포 및 흑색종, 섬유아세포, 수지상 세포 및 줄기세포 마커에 대한 R-T-P-C-R을 수행하였습니다.유전자는 세포가 주변 기질이 아닌 종양에서 유래했음을 확인하는 데 사용됩니다. 성인 멜라닌 세포는 tear의 정상 대조군 세포로, 배아 암세포주 N-C-C-I-T는 줄기세포 마커 CD 1 33의 양성 대조군으로 사용되었습니다. 이러한 데이터는 일부 일차 세포가 실제로 tear 양성이며, 따라서 멜라닌 세포 유래임을 보여줍니다.배양물은 성숙한 수지상 세포의 표지자인 CD 83에 대해서도 음성을 나타냅니다. 흥미롭게도, 이 흑색종 세포주는 비대칭 세포 분열에 중요한 유전자이자 알려진 암 줄기세포 표지자인 CD 1 33을 발현합니다. 여기 제시된 이미지는 섬유아세포 제거 처리 후 섬유아세포가 심하게 오염된 일차 세포 배양의 명시야 현미경 사진이며, 이 배양물은 일차 흑색종 세포를 나타냅니다.일차 흑색종 세포를 CD 1 33 양성 세포와 CD 1 33 음성 세포로 분류하였습니다. 면역형광 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 얻은 이 데이터는 높은 분류 효율과 순도를 나타냅니다. 이러한 접근 방식은 환자 유래 조직과 세포를 사용하여 개별 환자의 약물 반응을 더 정확하게 예측할 수 있게 함으로써 맞춤 의학에 중요한 시사점을 제공합니다.이 방법은 종양이 어디에서 유래했는지, 환자를 어떻게 치료할 수 있는지와 같은 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 또한, 시스템 생물학적 접근 방식의 실험들을 검증함으로써 이를 더욱 명확하게 재정의하는 데 기여할 것입니다.

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연구

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암 줄기 세포 (CSCs)이 malignancies의 숫자에서 확인되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 인간의 췌장 선암의 xenografts에서 CSCs을 분리하는 알데히드 탈수소 효소의 활동과 CD44과 CD24 표현을 활용 흐름 cytometric 방법을 설명합니다. 이 가능한 전지는 다음 기능 분석 연구에 사용할 수 있습니다.

인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

여기 우리는 전체 murine 간, 조직 소화, 세포 강화, 그리고 유동세포계측법 절연을 요구하는 과정에서 CD133 표현 간 줄기 세포와 암 줄기 세포의 절연을 설명합니다. 우리는 고급 단일 세포 분리 및 clonal 확장 메서드를 포함합니다.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

이 기사에서는 인간 췌관 선암종(PDAC) 조직에서 췌장암 줄기세포(CSC)를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 CSC는 보다 효율적인 암 치료법을 개발하기 위해 CSC의 체외 자가 재생 능력에 대한 약물 치료의 기능적 효과를 연구하는 데 사용됩니다.

PDAC 줄기세포 분리: 췌장 종양에서 암 줄기세포를 분리하는 방법

이 동영상은 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 1차 흑색종 세포주에서 CD133 음성 및 양성 흑색종 줄기세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. CD133 양성 흑색종 CSC는 흑색종 종양 형성의 메커니즘을 이해하기 위해 추가로 연구됩니다.

흑색종 줄기세포 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 CD133 양성 및 음성 흑색종 세포를 얻는 방법

종양 재발과 치료에 대한 내성에서 암 줄기 세포의 역할을 이해하는 것은 지난 10년 동안 큰 관심사가 되었습니다. 이 논문은 두경부 편평 암종 세포주(HNSCC)에서 암 줄기 유사 세포의 하위 집단의 분리 및 특성화에 대해 설명합니다.

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 방법론의 목적은 유세포분석및 서양세포분석과 서양계의 기능성 분석및 현상형 특성화를 사용하여, 구형 프로토콜을 사용하여 암 세포주 및 원발성 인간 종양 샘플에서 암 줄기세포(CSC)를 식별하는 것입니다. 얼룩.

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

이 기사는 흑색종 전이의 새로운 후보 매개체와 그 작용 메커니즘을 테스트하는 데 사용되는 기술의 워크 플로우에 대해 설명합니다.

흑색종 전이의 새로운 중재자 식별을 위한 강력한 발견 플랫폼

이 논문에서는 M-LMD를 연구하기 위한 전임상 모델을 개발하기 위해 흑색종 관련 연수막 질환(M-LMD) 환자로부터 수집한 뇌척수액순환종양세포(CSF-CTC)의 증식을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Ex 생체 내 흑색종 관련 연수막 질환을 연구하기 위한 흑색종 환자의 대뇌 척수액 내 순환 종양 세포 배양

여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

배우세요 환자 유래 흑색종 세포 배양 및 MACS를 이용한 CD133+ 암 줄기 세포 분리 방법입니다. 적혈구와 섬유아세포를 제거하여 고순도 세포 집단을 얻고, 맞춤형 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연

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