환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연 + Putative 암 줄기 세포

이 절차의 전반적인 목표는 악성 흑색종에서 환자 유래 세포 배양을 확립하고 추정되는 CD 1 33 양성 암 줄기 세포를 분리하는 것입니다. 이는 세포 펠릿에서 적혈구를 고갈시킨 후 종양 조직에서 원발성 흑색종 단일 세포를 먼저 준비함으로써 달성됩니다. 필요한 경우 일차 세포 배양을 특성화하고 섬유아세포를 고갈시킵니다.

마지막 단계는 CD 1 33 양성 및 CD 1 33 음성 흑색종 세포의 자기 세포 분류를 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 이 최적화된 max 절차는 CD 1 33 양성 세포 및 CD 1 33 음성 세포의 고도로 풍부하고 생존 가능한 집단을 얻을 수 있는 훌륭한 방법입니다. 우리는 처음으로 이 기술을 사용하여 암 환자의 약물 반응을 예측하려고 시도하는 개인 맞춤형 의학에서 인스코 데이터를 검증했으며 이를 위해 상업적으로 이용 가능한 세포주를 사용할 수 없었습니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 악성 흑색종에서 암 줄기세포로 추정되는 CD 1 33 양성 세포에 빠르게 접근할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 제 연구실의 실험실 기술자인 Catherine Davis가 발표할 것입니다. 수술에서 갓 분리한 종양 조직을 1%페니실린 스트렙토마이신이 함유된 멸균 PBS의 조직 배양 실험실로 옮깁니다.

종양 조직을 멸균 페트리 접시로 옮기고 과도한 용액을 흡인합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 해리 혼합물을 넣고 새 멸균 메스를 사용하여 종양을 2-4mm의 작은 조각으로 다집니다. 이제 2-4g의 다진 종양 조직을 5ml의 해리 혼합물이 들어 있는 부드러운 max C 튜브로 옮깁니다.

페트리 접시를 추가로 4.5ml의 해리 혼합물로 헹구고 남은 조직 조각을 부드러운 max C 튜브에 추가합니다. 튜브를 닫고 해리 슬리브에 거꾸로 부착 한 다음 H 종양 제로 원 프로그램을 실행하십시오. 다음으로, 섭씨 37도에서 30분 동안 최고 실행 속도에서 연속 회전하면서 샘플을 배양합니다.

이제 튜브를 해리 슬리브에 거꾸로 부착하고 H 종양 제로 2 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 12RPM으로 연속 회전하면서 샘플을 배양합니다. 다음으로, 젠틀 맥스 프로그램 H tumor zero three를 실행합니다.

샘플을 재현탁하고 70미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50ml 튜브에 통과시킵니다. 필요한 경우 완전한 현탁액이 통과할 때까지 멸균 필터 팁으로 셀 현탁액을 저어줍니다. 세포 여과기를 5 밀리리터 양자 2 6 3 매체 펠릿으로 헹구고, 세포 현탁액을 300G에서 5분 동안 헹구고, 상층액을 버립니다.

세포의 입천장이 많은 양의 틱과 거짓말로 인해 읽히는 것처럼 보이면 동반 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 적혈구를 읽습니다. 양자 2, 6, 3에서 종양 세포를 다시 회전시키고 80% 합류점에 도달하면 세포를 정기적으로 배양합니다. 현미경을 사용하여 일차 세포 배양 표현형을 분석합니다.

그런 다음 CD NA 합성 후 RNA 추출을 위한 소량의 일차 세포 배양을 수확하고 종양 흑색종, 줄기 세포 및 기질 세포 마커 유전자에 대한 프라이머로 R-T-P-C-R을 수행합니다. 분석해야 할 가장 중요한 유전자는 섬유아세포 마커 CD 90, 암 줄기세포 마커 CD 1 33, 성숙한 수지상 세포 마커 CD 83 및 HPRT 또는 GAAP dh와 같은 하우스키핑 유전자를 찢는 흑색종 및 멜라닌 세포 마커입니다. 현미경 및 R-T-P-C-R 분석을 결합한 결과 1차 흑색종 배양액의 높은 섬유아세포 오염이 밝혀진 경우, 항섬유아세포, 마이크로비즈 및 LD 컬럼을 사용하여 섬유아세포를 고갈시킵니다.

prewarm PBS로 80% confluence cells를 세척하고 적절한 양의 Accutane을 첨가한 다음 세포가 배양 표면에서 분리될 때까지 배양합니다. 양자 2 6 3 배지에서 세포를 수확하고 50ml 튜브로 옮깁니다. 세포를 열거한 다음 300G 및 섭씨 4-8도에서 5분 동안 필요한 수의 세포를 원심분리합니다.

상층액을 완전히 흡인하고 소생시킵니다. 최대 350 마이크로 리터의 완충액에 10 배의 여덟 번째 세포를 1 회 중단하고 100 마이크로 리터의 FCR 차단 시약과 50 마이크로 리터의 CD 1 33을 추가합니다. 비오틴 1개.

잘 섞어 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 최대 10ml의 완충액으로 세포를 세척한 다음 300G과 섭씨 4-8도에서 5분 동안 원심분리합니다. 두 번째 세척 후 상층액을 완전히 흡인하십시오.

세포 펠릿을 400마이크로리터의 최대 완충액에 재현탁합니다. 100 마이크로리터 항 비오틴 마이크로비즈를 넣고 잘 섞어 섭씨 4-8도에서 15분 동안 배양합니다. 한편, 자기 분리를 위해 최대 분리기를 준비하려면 quadro max를 최대 분리기 multis 스탠드에 부착합니다.

컬럼 날개가 있는 LS 컬럼을 quadro max의 자기장에서 앞쪽으로 필요한 수만큼 삽입합니다. 각 LS 컬럼과 적절한 수집 튜브에 pres 분리 필터를 배치합니다. 각 컬럼 아래에서 필터와 컬럼을 최대 3ml의 버퍼로 헹구고 플로우 스루를 버립니다.

앞서 설명한 대로 최대 완충액에서 세포를 세척한 후 500마이크로리터 최대 완충액에 세포를 재현탁하고 준비된 LS 컬럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 컬럼당 최대 3ml의 버퍼로 세 번 세척합니다. 표지되지 않은 cd 1 33 음성 세포 분획의 총 풍요로움을 수집합니다.

그런 다음 프레스 분리 필터를 폐기합니다. 분리기에서 컬럼을 제거하고 적절한 수집 튜브에 놓습니다. 최대 5ml의 완충액을 적용합니다.

음극 분획의 순도를 높이기 위해 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 라벨이 부착된 CD 1 33 양성 세포를 즉시 씻어냅니다. 세포 현탁액을 새로운 평형 LS 컬럼에 적용하고 유출 CD 1 33 음성 분획을 수집합니다. 이 절제된 림프절 전이는 말기 흑색종 환자로부터 얻었습니다.

조직의 기계적 및 효소적 해리 후, 여과된 세포의 펠릿은 적혈구로 높은 오염을 함유했습니다. 그 후, 적혈구가 고갈되면 연한 갈색의 세포 알갱이가 생성되었습니다. 이 세포는 여기에서 양자 2 6 3 배지, 멜라닌 세포 및 흑색종의 R-T-P-C-R, 섬유아세포, 수지상 및 줄기 세포 마커에서 배양되었습니다.

유전자는 세포가 주변 기질이 아닌 종양에서 유래했는지 확인하는 데 사용됩니다. 성체 멜라닌 세포는 눈물에 대한 정상 대조 세포로, 배아 암종 세포주 N-C-C-I-T는 줄기 세포 마커 CD 1, 33에 대한 양성 대조군으로 작용했습니다. 이러한 데이터는 일부 일차 세포가 실제로 눈물에 양성이며 따라서 멜라닌 세포 기원임을 보여줍니다.

이 배양물은 성숙한 수지상 세포의 마커인 CD 83에 대해서도 음성입니다. 흥미롭게도, 이 흑색종 세포주는 비대칭 세포 분열에 중요한 유전자인 CD 1 33과 알려진 암 줄기 세포 마커를 발현합니다. 여기에 표시된 것은 섬유아세포 고갈 처리 후 섬유아세포로 심하게 오염된 일차 세포 배양의 명시야 현미경 사진이며, 배양액은 원발성 흑색종 세포를 나타냅니다.

원발성 흑색종 세포는 CD 1 33 양성 세포와 CD 1 33 음성 세포로 분류하였다. 면역형광, 염색 및 웨스턴 블롯 분석에서 얻은 이러한 데이터는 높은 분류 효능과 순도를 나타냅니다. 이 접근 방식은 이제 환자 유래 조직과 세포를 사용하여 각 환자의 약물 반응을 개별적으로 더 잘 예측할 수 있기 때문에 개인 맞춤형 의료에 큰 영향을 미칩니다.

이 방법은 종양이 어디에서 유래하는지와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 환자는 어떻게 치료할 수 있습니까? 또한 실험을 검증하여 시스템 생물학 접근 방식을 더 잘 재정의하는 데 도움이 될 것입니다.