기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

이 절차의 전반적인 목적은 원발성 뉴런 결장 종양 오가노이드를 확립하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 결장 종양 조직을 수집하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 인접한 정상 결장 상피를 해리하는 것입니다.

다음으로, 대장 종양 세포는 단일 세포로 소화됩니다. 마지막 단계는 대장 종양 세포를 마트리겔에 삽입하고 제한된 영양 조건에서 선택적으로 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 광학 현미경은 대장 종양 오가노이드 형성의 시간 경과를 보여주는 데 사용됩니다.

형질전환된 대장암 세포주와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 오가노이드 배양이 in vivo 상태를 밀접하게 모방하고 생리학적으로 더 관련성이 높은 데이터를 생성한다는 것입니다. 생쥐를 이산화탄소로 안락사시키고 결장을 채취한 후 PBS로 결장을 씻어냅니다. 가위를 사용하여 결장을 세로로 연 다음 실체 현미경 아래에 놓고 가위를 사용하여 종양이 있는 영역을 제거합니다.

PBS로 종양 조직을 수집하고 세척합니다. 세척 후 장 조각을 EDTA 킬레이트화로 옮기고 완충액을 바르고 킬레이트화 후 60분 동안 얼음에서 배양하면 대부분의 정상 장 상피 세포는 분리되고 종양 세포는 기계에 부착된 상태로 유지됩니다. 정상 상피 세포를 포함하는 킬레이트 완충액을 흡인하고 나머지 종양 단편을 세척합니다.

또 한 번. 5ml의 콜드 킬레이트 버퍼가 있습니다. 킬레이트 완충액을 흡인시킨 후 5ml의 차가운 XPBS로 종양 조각을 세척합니다.

XPBS를 흡인시킨 후 조직 조각에 소화 완충액을 추가하고 2시간 동안 배양합니다. 섭씨 37도에서 종양 조각이 정상 중력 하에서 1분 동안 가라앉도록 한 다음 15ml 원심분리기 튜브에 S 상층액을 수집합니다. 단세포 종양 현탁액을 200배 G에서 3분 동안 원심분리하여 수피네이트를 펠렛

그런 다음 5ml의 PBS와 원심분리기로 한 번 세척합니다. 다시 말하지만, 500마이크로리터의 PBS로 종양 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 혈액 세포 분석기를 사용하여 분리된 단일 종양 세포를 계수합니다.

다음으로, 200배 G에서 3분 동안 원심분리하여 종양 세포를 감고 얼음 위에 1밀리리터당 5밀리그램의 마트리겔을 다시 보냅니다. 그런 다음 15, 000 세포를 24 웰 플레이트의 웰 당 50 마이크로 리터 용량의 matrigel에 플레이트합니다. 마트리겔 세포 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 중합시킨 후, 밀리리터 소변 EGF당 50나노그램을 함유하는 500마이크로리터의 기저 배양 배지를 각 웰에 첨가하고, 2일에 한 번씩 EGF를 교환하고, 일주일에 한 번 오가노이드 1-5개를 마사지하여 마사지합니다.

배양 배지를 새로운 기초 배지로 교체한 후 절단된 피펫 팁이 있는 P 1000 피펫을 사용하여 오가노이드와 마트리겔을 기계적으로 파괴합니다. 오가노이드 현탁액을 15ml 팔콘 튜브로 옮깁니다. 불에 광택을 낸 파스타 피펫을 사용하여 오가노이드를 더욱 파괴합니다.

해리된 오가노이드를 5ml의 기초 배양액, 배지 및 원심분리기로 200배 G로 2분 동안 세척합니다. 그런 다음 supinate를 버리고 앞에서 설명한 대로 펠릿을 matri gel과 plate로 재현탁하여 오가노이드를 동결하고 세척 및 원심분리기를 분리합니다. 이전과 마찬가지로 supinate와 resus를 버리십시오.

20%fetal bovine serum과 10%dimethyl sulf oxide를 함유한 DMEM에 펠릿을 현탁시킵니다. 다음으로, 세포 현탁액을 1.5ml 극저온 튜브로 옮깁니다. 튜브를 Nalgene Mr.Frosty 냉동 용기로 옮기고 영하 80도의 냉동고에 보관하면 분당 영하 1도의 냉각 속도를 얻을 수 있습니다.

하룻밤 배양 후 세포를 액체 질소로 옮깁니다. 이러한 방식으로 세포를 2년 이상 보관할 수 있습니다. RNA 추출을 위해 세포를 수집합니다.

계대 형성의 경우, RNA는 pico pure RNA isolation kit를 사용하여 분리됩니다. 단백질 추출에 대한 제조업체의 지침에 따라 세포 펠릿은 일반적인 방식으로 수집된 다음 면역조직화학을 위한 100마이크로리터의 방사 면역침전 분석 버퍼에 놓입니다. 세포 배양 배지를 흡인한 후 cut P 1000 피펫을 사용하여 종양 오가노이드를 cryo mold로 옮깁니다.

드라이아이스에 주형을 놓고 주형에 조직 동결 매체를 첨가하여 얼어붙은 부분을 7미크론으로 자르고 염색합니다.이전에 발표된 프로토콜에 따르면 이 이미지는 도금 후 잠시 후 3개월 된 PC min 마우스에서 채취한 결장 종양에서 파생된 대표적인 오가노이드 형성을 보여줍니다. 이 이미지는 도금 하루 후 동일한 오가노이드를 보여줍니다. 여기에서 오가노이드는 3일 동안 배양되었습니다.

이 이미지는 도금 후 6일 후의 오가노이드를 보여줍니다. 다음은 14일 동안 배양된 두 개의 오가노이드입니다. 이 단계에서 각 오가노이드는 세포 클러스터로 구성됩니다.

이 히스토그램은 두 가지 다른 콜라겐분해효소 분해 조건에서 오가노이드 형성의 성공적인 속도를 보여줍니다. 이 이미지는 생후 3개월 된 대장 종양에서 추출한 오가노이드를 보여주며, 베타 카테닌에 대한 면역형광 염색이 있는 PC min 마우스입니다. DPI는 핵을 염색하는 데 사용되었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 효소 분해를 통해 원발성 요로 대장 종양 OID를 확립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.