에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임 Drosophila

이 절차의 목적은 초파리 유충 CNS의 복부 신경삭에 찌르는 부상을 입히고 이 손상에 대한 세포 반응을 유도하는 것입니다. 이것은 reg 산란 후 최대 96 시간까지 유충을 먼저 준비함으로써 수행됩니다. 그런 다음 유충 CNS를 절개하고 미세한 혀 선미 바늘을 사용하여 복부 신경삭을 찔러 넣습니다.

마지막 단계는 찔린 복부 신경삭을 배양한 다음 고정하여 면역 염색을 하거나 타임랩스 기록을 위해 배양하는 것입니다. 궁극적으로 샘플의 컨포칼 현미경 검사는 상처 진행의 역학과 신경교세포 증식, 세포사멸 및 형태학의 변화를 보여줄 수 있습니다. 성충 파리에 대한 부상과 같은 16가지 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 여전히 기능적 중추 신경계의 패러다임이지만 유충 CNS는 기술적으로 더 접근하기 쉽다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 위생 상태를 보장하여 해부 단계를 시작하지 않으면 정맥 신경 코드가 퇴화할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 70% 에탄올로 벤치와 손을 청소하십시오. 기구는 70% 에탄올에 적신 티슈로 싸서 따로 보관해야 합니다.

유충을 다룰 준비가 되면 조직의 포장을 풀고 기구를 자연 건조시킵니다. 이러한 프로토콜의 경우 집게 끝이 완벽하게 만나는 것이 중요합니다. 그들이 그것을 조정하지 않는다면, 아칸소 스톤을 사용하는 것은 동일합니다.

염색 블록 1개에는 증류수를 넣고 3개의 블록에는 2ml의 M 3 PS 배지를 넣습니다. 96시간 된 용암이 담긴 바이알을 선택하고 물을 약간 넣으십시오. 그런 다음 주걱을 사용하여 유리병에서 유충이 든 음식을 부드럽게 꺼내 젖은 종이 타월에 펴 바릅니다.

스프레드에서 10 마리의 유충을 물과 함께 염색 블록으로 옮깁니다. 용암을 완전히 청소하기 위해 물을 여섯 번 교체하십시오. 그런 다음 물을 M 3 PS 매체로 교체합니다.

유충 중 하나를 M three PS media의 염색 블록으로 옮기고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 조직 손상을 최소화하면서 VNC를 제거합니다. 먼저 용암 등쪽을 위로 향하게 놓습니다.

그런 다음 앞쪽 끝에서 1/3 거리에서 두 쌍의 집게로 등쪽을 잡습니다. 그런 다음 겸자로 표피를 찢어 뒤쪽 끝을 잡아 당깁니다. 다음으로, 뇌에 가장 가까운 내장을 잘라내면 음식물이 많이 들어있지 않아야 한다.

뇌와 VNC는 이제 전반의 뒤쪽 가장자리에서 볼 수 있습니다. 지방체, 장, 표피를 정중하게 제거합니다. 흉부 VNC를 통해 두 쌍의 집게를 서로 가까이 놓고 잡아당겨 말초 신경을 제공합니다.

흉부 VNC에서 디스크나 말초 신경을 당기거나 찢어버리지 마십시오. 그렇지 않으면 입안이 퇴화할 수 있습니다. 부분은 VNC에 부착된 상태로 둘 수도 있습니다.상상 디스크는 뇌에 부착된 상태로 두어야 합니다. 이제 더 젖어 P 20이 넓어졌습니다.

TIP을 M three PS medium에 넣고 vnc를 손상시키기 전에 새로운 M three PS medium이 포함된 염색 블록으로 VNC를 옮기는 데 사용합니다. 충분히 모여있는지 확인하십시오. 타임 랩스에는 4-5개가 필요하지만 면역 염색에는 24개 이상이 필요합니다.

해부 현미경으로 M three PS가 들어있는 깨끗한 염색 블록에 VNC 1개를 옮기고 등쪽 신경 알약을 시야에 넣습니다. 이것은 광학 엽이 부착된 VNC의 가장 자연스러운 방향입니다. 이제 한 번만 스텐 바늘을 사용하여 거의 직각으로 등쪽에서 VNC를 수동으로 찌르고 VNC의 복부 절반을 겨냥하십시오.

찌르면 조직 아래의 유리 표면에 부드럽게 부딪힐 것입니다. 따라서 바늘 끝이 다음 시도를 위해 여전히 충분히 날카로운지 정기적으로 확인하는 것이 중요합니다. 무뎌진 경우 팁을 날카롭

아칸소 스톤 또는 이에 상응하는 찌르기 통풍구를 사용하여 탱고 얼룩 바늘이 있는 신경 보호대는 부상 패러다임이기 때문에 이 절차에서 가장 중요한 단계입니다. 바늘이 너무 뭉툭하면 상처가 너무 커지고 신경 보호대가 생성할 수 있는 통풍구가 생길 수 있습니다. 찌르는 경우 바늘 홀더의 줄기가 매체에 닿지 않도록 할 때 완료되면 형광 면역 염색 후에도 상처가 보이지 않습니다.

배양 22시간 후 고정된 건강한 VNC에서는 퇴행의 징후가 관찰되지 않습니다. 이 절차는 찌른 후 22시간 후에 찌르기와 관련이 없는 VNC 내에서 세포 변성을 초래할 수 있습니다. 거친 표면, 특히 화살촉이 가리키는 것처럼 흉부의 측면 복부 영역에서 거친 표면을 찾으십시오.

극단적인 경우에는 VNC가 돌출됩니다. 또한 흉부 신경 알약에서 구멍이나 액포를 찾으십시오., 형광 면역 염색 후 구멍으로 보일 수 있습니다. 화살촉에 있는 구멍을 주목하십시오.

신경 알약에서 이러한 퇴행 징후가 있는 샘플은 폐기해야 합니다. 살아있는 VNC에서 축삭 신경 알약을 시각화하려면 모든 축삭을 표시하는 G nine이라는 GFP 단백질 트랩을 사용합니다. 정중선 gl을 제외한 모든 신경교세포를 시각화하려면 예를 들어 U-A-S-D-S 빨간색 S 1 97 Y 기자 파리와 함께 glial driver repo G four를 사용하여 두 기자를 모두 태우고 녹색 축삭돌기와 빨간색 GL을 가지고 있으며 이는 시간 경과에 생체 조직에 기록될 수 있습니다.

필요한 동물의 VNC를 찔렀을 때, 기자는 찔린 VNC를 1 밀리리터의 M 3 PS 미디어가 있는 폴리올 라이신으로 코팅된 3.5mm 유리 바닥 접시에 옮깁니다. 다음으로 VNC 등쪽을 아래로 향하게 놓고 집게의 평평한 면을 사용하여 VNC를 접시에 부드럽게 눌러 붙도록 합니다. 이제 섭씨 25도의 제어 이미징 챔버에 15%FPS의 M three PS 1밀리리터를 조심스럽게 추가하십시오. 다소 제한된 LIR SP two에서 컨포칼 현미경을 사용하여 VNC의 이미지를 획득합니다.

4배 확대/축소가 가능한 20 x 대물렌즈를 사용합니다. 스캔 모드를 XYZT로 설정합니다. 픽셀 해상도를 512 정사각형으로 설정합니다.

Z 단계를 1미크론으로 설정하고 1시간 또는 2시간 간격으로 이미지를 수집합니다. 이러한 설정을 통해 8-9개의 시간 지점을 다른 컨포칼 현미경에서 스캔할 수 있습니다. 더 오랜 시간 동안 이미지 스택을 획득하도록 설정을 조정합니다.

최대 24시간까지 포인트가 적립됩니다. VNC 병변은 G 9 축삭 마커가 있는 표본의 신경 알약 내 GFP 음성 영역으로 시간 경과에서 시각화되었으며, 구멍 또는 액포처럼 보이는 작은 GFP 음성 영역이 나타나기 시작한 직후였습니다. 이러한 GFP 음성 영역은 일반적으로 찌른 후 최대 6-8 시간까지 확대되었습니다.

그 후, GFP 음성 영역은 더 줄어들었고 일부는 찌른 후 22시간까지 사라졌습니다. 상처가 차지하는 면적은 일반적으로 칼에 찔린 후 6-8시간 후에 볼 수 있는 최대 면적보다 작았다. 마찬가지로, 신경교돌기에서 DS 적색 음의 영역은 초기에 증가했다.

그러나 칼에 찔린 후 22시간이 지나자 줄어들었다. 흥미롭게도, 종종 DS 적색 양성 신경교세포돌기는 그들이 사라지기 전에 신경 알약의 GFP 음의 구멍을 메웠습니다. 신경교세포막에 항 GFP를 라벨링하기 위해 repo GAL 4 및 U-A-S-M-C-D-H-G-F-P가 부착된 고정 표본의 면역 염색 결과 등쪽 찌르는 부상으로 인해 움푹 들어간 곳이 발견되었습니다.

복부 찌르기는 표면과 피질의 신경교세포보다 신경 알약 및 신경 알약 관련 신경교세포에 더 심각한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 신경교돌기(glial process)는 신경 알약(neuro pill)에서는 무질서한 것처럼 보였지만, 피질(cortex)에서는 여전히 VNC를 덮고 있었고 조직화(mesh)와 같은 조직을 유지했다. 부상으로 인해 화살촉이 지적한 대로 GS 두 개의 양성 세포 파편이 생성되었습니다.

파편은 정상 세포와 구별됩니다. 그것은 훨씬 더 작고 세포체에 연결되어 있지 않습니다. 이것은 신경 알약 관련 신경교세포, 항 절단 카스파제에 대한 손상을 밝혔습니다.

3건의 양성 세포사멸. 염색은 뉴런과 신경교세포(glial cell) 모두에서 관찰되었는데, 이는 그들이 찔린 부상 시 세포사멸(apoptosis)을 겪었음을 보여주었다. 이 기술을 숙달하면 1-2시간 안에 완료할 수 있습니다.

환기 신경 코드를 해부하고, 찌르고, 타임 랩스 컨포칼 현미경을 위해 설정하는 데 1시간이 걸리며, 2시간 안에 24개의 환기 신경 코드를 절개하고, 찌르고, 배양을 위해 설정한 후 원하는 시점에 샘플을 고정할 수 있습니다.