췌장암의 진행 발광 동소 모델

이 절차의 전반적인 목표는 종양 발달을 비침습적으로 모니터링하기 위해 생체 내 생물 발광 이미징을 사용하는 췌장암의 정소성 마우스 모델을 준비하는 것입니다. 이는 Matrigel에서 루시페라아제 태그가 지정된 암세포를 먼저 현탁액으로 복원하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 복강을 열고 췌장을 찾아 고정하기 위해 개복술을 시행

다음으로, 마트리겔의 종양 세포 현탁액을 췌장에 주입합니다. 마지막 단계는 췌장을 교체하고 봉합사를 사용하여 복강을 닫는 것입니다. 궁극적으로 생물 발광 이미징은 종양 진행을 모니터링하고 치료 개입에 대한 반응을 추적하는 데 사용됩니다.

췌장암의 시험관 기반 세포 분석 또는 피하 모델에 비해 이 모델의 주요 장점은 췌장 종양 세포와 췌장 미세환경 사이의 상호 작용을 실제로 조사할 수 있다는 것입니다. 이 모델에서 질병 진행의 동역학은 재현성이 높고 짧은 시간 내에 발생하므로 이 모델은 췌장암의 새로운 치료법을 검사하는 데 유용하며, 이 모델의 실제 입증이 중요합니다. 종양 세포의 주입은 누출을 방지하기 위해 신중하게 수행되어야 하므로 이 절차를 배양하기 시작합니다.

서면 프로토콜에 기술된 바와 같이 루시페라아제를 발현하도록 형질도입된 췌장암 세포는 70% confluent가 될 때까지 그 후, 0.05%tripsin EDTA로 세포를 수확하고, 혈류 세포 분석기를 사용하여 계수하고, 생존율이 90% 이상인지 확인하고, 다음으로, 원심분리 후 5분 동안 200배 중력에서 부드럽게 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 상층액을 제거하고 췌장암 세포를 밀리리터당 2,000만 개의 세포로 재현탁시킵니다. 마트리겔과 식힌 PBS를 3-2개 섞은 혼합물에 얼음 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 0.3 밀리리터 29 게이지 인슐린 주사기를 사용합니다.

준비된 마트리겔 세포 현탁액을 주사기에 끌어 올립니다. 이 절차를 시작하려면 2-3%의 흡입된 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 1-2분 후 마우스의 발가락을 부드럽게 꼬집어 마취 깊이를 확인하여 페달 반사가 부족한지 확인합니다.

다음으로, 수술 중 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 충분한 윤활제를 바릅니다. 그런 다음 섭씨 37도의 가열 패드에 마우스를 등을 대고 마우스를 부드럽게 돌려 복부의 왼쪽을 들어 올립니다. 올바른 방향이 잡히면 수술을 위해 마우스의 복부를 준비합니다.

멸균 수술 기구를 사용하여 정중선에서 측면으로 약 2mm 떨어진 피부를 1.5cm 절개합니다. 그런 다음 아래 복부 근육을 1.5cm 절개합니다. 다음으로, 멸균 집게를 사용하여 비장을 찾아 복강을 위해 부드럽게 제거합니다.

멸균 면봉을 따라 비장을 고정하여 아래에 있는 췌장을 노출시킵니다. 그런 다음 비장 공회에 인접한 췌장의 꼬리를 찾습니다. 마트리겔 세포 현탁액을 현탁시키고 주사 후 췌장 꼬리에 20마이크로리터를 주입합니다.

마트리겔이 응고될 시간이 있을 때까지 30-60초 동안 주사기를 제자리에 고정하여 세포 누출을 최소화하는 이 중요한 단계를 수행합니다. 바늘을 제거한 후 주입 부위를 검사하여 누출이 발생하지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음 비장과 췌장을 복강으로 되돌립니다.

연속 스티치를 사용하여 둥근 바늘로 흡수성 꼰 4 aut 봉합사로 마우스의 복부 근육 조직을 닫습니다. 다음으로 비흡수성 모노필라멘트로 외부 피부를 닫습니다. 연속 스티치를 사용하여 절단 바늘로 6 aut 봉합하고 Betadine을 적용합니다.

그런 다음 흡입된 마취제에서 마우스를 제거하고 킬로그램당 0.05-0.1mg의 부프레노르핀을 피하에 주입합니다. 수술 후 진통제로, 쥐가 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 섭씨 37도의 가열 패드에 놓인 케이지에서 회복할 수 있도록 합니다. 수술 후 처음 며칠 동안은 마우스를 계속 면밀히 모니터링하십시오.

쥐가 몸을 구부리거나 거동이 불편해지는 등의 통증 징후를 보이면 36시간 동안 12시간마다 부프레노르핀을 피하로 투여할 수 있습니다. 수술 부위가 7-10일 안에 치유된 후 마우스를 마취하고 외부 봉합사를 제거합니다. 췌장암 세포의 생물 발광 추적을 시작합니다.

불소 2-3%를 흡입하여 마우스를 다시 마취하고 눈에 윤활제를 바르면 건조가 죽지 않습니다. 마취가 끝나면 꼬리 정맥 주사를 통해 루시퍼 1kg당 150mg을 주입하고 루시퍼가 세포로 이동할 때까지 1-2분 동안 기다립니다. 생물 발광 이미징 시스템에서 마우스를 오른쪽에 놓아 종양이 카메라를 향하도록 합니다.

여기서는 Illumina two 이미징 시스템을 사용하고 있습니다. 그런 다음 다른 JOV 기사에서 이전에 설명한 대로 이미징 소프트웨어를 사용하여 백색광 및 생물 발광 이미지를 캡처합니다. 이미징이 완료되면 흡입된 마취제에서 마우스를 제거하고 가정용 케이지에서 회복할 수 있도록 합니다.

종양 성장을 조사하기 위해 종양 성장 기간 동안 이 단계를 반복합니다. 동력학. 루시퍼라제 태그가 지정된 세포주를 사용하면 종양 성장을 측정할 수 있는 고유한 방법을 얻을 수 있습니다. 비침습적으로. 여기에 표시된 것은 상대적으로 작은 종양을 주입한 후 10일, 종양이 커진 경우 주입 후 31일, 종양을 절제한 후 5일 후의 마우스입니다.

이 이미지에서 볼 수 있는 생물 발광은 절제 후 5일 후 췌장 종양의 재발과 인근 간으로의 전이를 보여줍니다. 여기에 표시된 그래프는 마트리겔 세포 주입 방법에 대한 유사한 성장률을 보여줍니다. 이 비디오에 설명된 내용은 췌장 종양 조각을 이식하는 또 다른 방법을 비교했습니다.

유사한 성장 역학은 pan one과 capin one 모두에서 볼 수 있습니다. 희생, H 및 d 염색 후 세포주를 수행하여 췌장암 세포가 노란색 별표로 표시된 주변 췌장 조직으로의 침습적 특성과 여기에 표시된 간을 포함한 다른 장기의 전이를 보여주기 위해 수행되었습니다. 이 방법을 마스터하면 약 10분 안에 완료할 수 있습니다.

또한 전이성 및 재발성 질환 진행에 대한 바이오 센트 시각화는 현재 대부분의 암 치료법이 완화적이기 때문에 이 모델을 임상적으로 관련성 있게 만듭니다.