마우스의 급성 신장 손상 및 사후 상해 섬유증의 허혈 - 재관류 모델

이 절차의 전반적인 목표는 일관되게 생존 가능하고 기능적으로 측정 가능한 정도의 허혈을 유도하는 것입니다. 재관류는 편측 신장 척추경 클램핑을 수행한 후 반대쪽 신장 절제술 허혈을 수행하여 마우스에서 급성 신장 손상을 유발했습니다. 재관류 손상은 등쪽을 절개하고 왼쪽과 오른쪽 신장 척추경을 노출시켜 이루어집니다.

여기에는 신장 동맥과 정맥이 포함됩니다. 다음으로, 주변 조직으로부터 신장을 해방한 후 반대쪽 신장 절제술을 시행합니다. 그런 다음 혈관 클램프를 사용하여 왼쪽 신추 경을 고정하고 신장을 피부로 덮습니다.

마지막으로, 미리 결정된 시간이 지나면 클램프가 해제되고 신장이 재관류가 허용되며 신장이 후복막 공간으로 다시 밀어 넣어집니다. 궁극적으로, 신장 손상의 기능 분석은 반대쪽 신장 허혈 제거 후 24시간 후에 효소 캐스케이드 분석을 사용하여 혈청 크레아티닌 수치 분석을 통해 수행할 수 있습니다. 재관류 손상은 급성 신장 손상의 메커니즘과 치료를 연구하는 데 널리 사용되는 모델입니다.

이 기법 자체는 비교적 간단하지만, 많은 실험실에서 이 기법을 재현하기 어렵고 폐사율이 높으며 하루에 5-10회의 수술만 할 수 있는 상대적으로 낮은 처리량을 발견한 여러 가지 변수가 있습니다. 나중에 이 기법을 소개할 Skrinick 박사는 저희 연구실에서 이 기법을 개발하는 데 수년을 보냈으며, 낮은 폐사율과 상대적으로 높은 처리량으로 훨씬 더 재현성이 높은 프로토콜을 고안했습니다. 날씨가 좋은 날에는 NA가 하루에 40-50건의 수술을 할 수 있어 수술을 준비할 수 있습니다.

모든 수술 기구를 여러 마리의 쥐에 사용할 경우 오토클레이브하고 시술 사이에 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여 치료하십시오. 수조 시스템을 사용하는 경우 수술 1시간 전에 온도를 섭씨 38도로 설정하고 마우스의 무게를 잰 다음 0.5ml의 멸균 생식염수를 피하 주사합니다. 알레인, 케타민 혼합물의 복강 내 주사를 사용하여 마우스를 마취한 후 수술 부위를 면도하고 안과 연고를 바르면 마우스 각막을 보호합니다.

엎드린 자세로 마우스를 흡수성 벤치 패드가 늘어선 가열된 표면 위로 옮기고 Betadine 용액을 사용하여 다리를 수술 표면에 테이프로 붙입니다. 사이트 중앙에서 주변으로 스크럽한 다음 노바칸을 총 3번 수행합니다. 멸균 수술용 드레이프로 수술 부위를 덮으십시오.

다음으로, 피부를 통해 신장 위치를 촉진합니다. 그런 다음 가위와 집게로 마우스의 정중선을 따라 등 피부를 자릅니다. 절개 부위를 통해 왼쪽과 오른쪽 등쪽의 피부와 피하층을 분리합니다.

오른쪽 옆구리, 오른쪽 신장 위의 근육과 근막을 작게 절개하여 외부로 내보내고, 신장의 상극과 하극을 주변 조직으로부터 자유롭게 조심스럽게 절개합니다. 부신은 또한 내측에서 외측으로 휩쓸고 지나가면서 뭉툭한 집게로 조직을 부드럽게 분리함으로써 혈액 공급과 함께 오른쪽 신장의 상극에서 부드럽게 제거됩니다. 이것은 비디오로 시연하기가 약간 어렵지만 이해할 수 있습니다.

그림 1에 표시된 혈액 공급이 있는 부신의 해부학적 구조를 살펴본 다음 4개의 실크 봉합사를 사용하여 고막 주위에 이중 수술 매듭을 묶습니다. 봉합사의 한쪽 끝을 약 2인치 길이로 남겨두고 신장을 지탱하여 절단 부위를 시각화하는 동시에 매듭 원위부를 절단하는 데 사용합니다. 멸균 식염수를 사용하여 그루터기를 관개하십시오.

그런 다음 흡수성 봉합사로 왼쪽으로 이동하는 근육층을 닫습니다. 왼쪽 옆구리와 왼쪽 신장 위의 근막을 작게 절개하고 뭉툭한 집게로 바깥쪽을 만듭니다. 두 번째 집게 세트로 주변 지방 조직에서 신장 척추경을 분리하면서 신장을 조심스럽게 잡습니다.

신장 손상을 유발할 수 있는 신장에 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의합니다. 실험에 가짜 수술 대조군을 포함하는 경우, 가짜 수술 마우스는 주변 지방에서 신장 척추경을 분리하는 것을 포함하여 손상된 마우스와 정확히 동일한 절차를 거쳐야 하지만 혈관 클램프는 신장 척추경에 배치되지 않습니다. 다음으로, 신장 원천 겸자를 안정화하는 동안 비외상성 혈관 클램프를 사용하여 왼쪽 신장 척추경을 클램핑합니다. 클램프 클램핑 시간은 클램프가 제자리에 있는 동안 필요한 마우스의 긴장과 부상의 정도에 따라 달라집니다.

왼쪽 신장을 피부로 덮은 후 식염수를 적신 멸균 거즈를 사용하여 피부 절개 부위를 덮습니다. 그런 다음 원하는 시간이 지난 후 수술 부위를 보호하기 위해 멸균 드레이프로 마우스를 덮고 신장을 노출시킵니다. 균일한 어스름한 모양인지 확인한 다음 클램프를 해제하십시오.

신장은 재관류 후 빠르고 균일하게 분홍색을 띠어야 합니다. 신장을 후복막 공간으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 다음으로, 흡수성 봉합사로 근육층을 닫고 클립으로 피부를 닫고, 그램당 0.05마이크로그램의 부프레노르핀 진통제와 0.5ml의 멸균 생리식염수를 피하로 투여합니다.

그런 다음 마우스를 가열 패드에 옮기고 최대 5명까지 동물실로 옮기기 전에 깨우십시오. 수술 후 생쥐를 각 케이지에 넣고 생쥐를 면밀히 관찰하고 필요에 따라 8-12시간마다 손의 통증이나 불편함을 위해 추가 진통제를 투여할 수 있습니다. 반대쪽 신장 절제술을 동시에 시행하는 편측 IR 손상은 양측 IR 손상과 비교할 때 결과의 변동성을 크게 줄입니다.

이 절차를 통해 50-60%의 생쥐에서 부상 후 24시간 이내에 예상되는 신부전이 발생합니다. 실질적인 측면에서, 이것은 나머지 마우스가 매우 적은 부상을 입거나 훨씬 더 심각한 부상을 입었기 때문에 이 모델을 사용하는 데 여전히 상당한 변동성이 있음을 의미합니다. 우리의 목적을 위해 이 문제를 최소화할 수 있습니다.

우리가 사용하는 치료 그룹은 일반적으로 초기 부상 후 24시간 또는 그 이후에 시작되기 때문입니다. 이러한 방식으로, 24시간 시점의 크레아티닌을 얻은 후 다른 치료 부위에 마우스를 무작위 배정할 수 있습니다. 크레아티닌 수치가 미리 결정된 범위를 벗어난 마우스는 이 시점에서 추가 연구에서 제외됩니다.

중등도의 부상의 경우, 일반적으로 혈청 크레아티닌 수치가 데시리터당 0.8-1.2mg 범위를 벗어난 마우스는 제외합니다. 반대쪽 신절제술과 동시에 편측 IR을 시행하는 것 외에도 편측 IR을 단독으로 시행합니다. 생쥐는 훨씬 더 긴 기간의 허혈을 견딜 수 있으며 부상 후 섬유증이 더 심해지는 경향이 있습니다.

그러나 이 모델에서는 편측성 IR 손상으로 인한 기능 회복을 평가하기 어렵기 때문에 신장 조직을 채취하지 않고는 손상의 중증도를 평가할 수 있는 방법이 없으며 장기 연구에서는 불가능할 수 있습니다. 이러한 이유로 우리는 심각한 편측성 IR 손상을 유도하고 최초 손상 후 8일 후에 반대쪽 신장 절제술을 시행하여 신장 기능 회복을 평가하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이 접근법을 사용하면 90-100%의 생쥐가 부상에서 살아남지만, 중요한 것은 생쥐가 매우 일관된 신장 손상을 일으켰고 9일째부터 급성 신장 손상 후 기능 회복을 평가할 수 있다는 것입니다.

신장 손상의 일관성과 예측 가능성은 수술 중 수행되는 단계의 일관성과 정밀도에 크게 좌우됩니다. 일단 마스터하면 이 기술은 35-40분 안에 완료할 수 있으며 한 번에 5-10마일에서 동시에 수행할 수 있습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 하루에 40-50마일까지 운행했으므로 즐겁고 행운을 빕니다.