비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

이 절차의 전반적인 목표는 maldi 질량 분석법을 통해 100킬로달톤보다 큰 원형(intact) 단백질을 민감한 방식으로 분석하는 것입니다. 이는 먼저 매트릭스 솔루션을 준비하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 박막 용액을 대상에 증착하는 것입니다.

다음으로, 샘플과 매트릭스 혼합물을 타겟에 증착합니다. 마지막 단계는 현미경으로 샘플 스폿을 관찰하는 것입니다. 궁극적으로 multi to mass spectrometer는 온전한 단백질을 분석하고 질량 스펙트럼을 기록하는 데 사용됩니다.

전기 분무 이온화와 같은 다른 분석 방법에 비해 maldi 질량 분석법의 주요 장점은 염분, 오염 물질 및 세제에 대한 내성이 더 우수하다는 것입니다. maldi의 또 다른 장점은 전기 스프레이에 비해 더 적은 전하를 운반하는 이온을 생성한다는 것입니다. 따라서 MDI 데이터를 획득하고 해석하는 것은 매우 간단합니다.

rech 결정화를 시작하려면 Pyrex que에 10ml의 40% 에탄올을 붓습니다. 그런 다음 600 밀리그램의 매트릭스에서 수조와 저항 히터를 사용합니다. 매트릭스 용액을 따뜻하게 하고 매트릭스가 완전히 용해될 때까지 저어줍니다.

용액이 포화될 때까지 이전 단계를 반복합니다. 용액을 실온에서 몇 시간 동안 천천히 식힌 다음 밤새 섭씨 4도에서 보관하십시오. 결정이 형성되지 않으면 용액 표면 바로 아래에 있는 비커 내부를 긁어 유리 막대를 사용하여 결정화를 유도합니다.

마지막으로, 여과에 의해 매트릭스 결정을 수집합니다. 플라스크의 잔류 결정을 최소량의 얼음처럼 차가운 용매로 헹구고 여과합니다. 여과가 완료되면 결정을 건조시켜 maldi 타겟 플레이트를 청소합니다.

메탄올로 헹구고 김 물티슈로 부드럽게 닦습니다. 그런 다음 물로 헹구고 김 물티슈로 닦으십시오. 600 밀리리터 비커에 maldi 타겟을 삽입하고 50 % 에탄올로 덮습니다.

다음으로, 초음파 수조에서 10 분 동안 에탄올 용액의 타겟을 초음파 처리합니다. 플레이트에 잔여물이 남아 있으면 이전 단계를 반복하십시오. 사용된 용매 또는 메탄올 또는 물로 대상을 헹구고 샘플이 얼마나 퍼지는지 확인합니다.

그런 다음 모든 액체가 Kim 물티슈에 모이도록 대상을 기울입니다. 질소 가스 흐름을 사용하여 대상을 건조시킵니다. 다음 단계에서는 알파 CHCA를 아세톤에 용해시킵니다.

포화 용액을 만들려면 10 마이크로 리터 피펫 팁을 알파 CHCA 포화 용액에 담그어 소량의 용액이 팁에 흐르도록합니다. 피펫 팁으로 maldi target을 빠르게 터치하여 1.5ml 플라스틱 튜브를 사용하여 alpha CHCA 용액을 maldi target에 증착합니다. 알파 CHCA 용액을 알파 CHCA 용액으로 표시 된 아세토 니트릴과 5 % 포름산의 7 대 3 부피 비율로 알파 CHCA를 용해하여 밀리리터 당 20 밀리그램 알파 CHCA 용액을 준비한다.

그 후, DHB를 아세틸 니트릴과 0.1 % 트리 플루오로 아세트산의 7 대 3 부피 비율로 용해시켜 DHB 용액으로 표시된 20 밀리리터 DHB 용액을 준비한다. 알파 CHCA 용액과 DHB 용액을 1:1 부피 비율로 혼합합니다. 이 절차를 시작하기 전에 C-H-C-A-D-H-B 용액을 얻기 위한 선택적 단계는 나열된 참고 문헌에 표시된 완충액 교환을 통해 단백질 샘플을 정제

그렇지 않으면 정제되지 않은 단백질 샘플을 MALDI 표적에 증착합니다. 다음으로, 준비된 알파 CHCA 박막에 0.5마이크로리터의 단백질 샘플을 증착합니다. 그 직후에 0.5 마이크로 리터의 C-H-C-A-D-H-B 용액을 첨가하십시오.

MALDI 플레이트에 0.5 마이크로 리터의 Cain 표준을 입금 한 다음 0.5 마이크로 리터의 매트릭스 용액을 첨가합니다. 샘플과 케인이 건조되면 현미경으로 반점을 관찰하고 표적을 기기에 삽입하고 적절한 기기 설정을 선택할 수 있습니다. 그런 다음 적절한 질량 대 충전 비율 범위를 선택하십시오.

ca의 스펙트럼을 획득하고 적절한 레이저 강도를 사용하여 기기를 보정합니다. 단백질 샘플의 스펙트럼을 획득합니다. 온전한 염색체 영역의 MALDI toff 분석 Maintenance one 단백질이 여기에 나와 있습니다.

C-H-C-A-D-H-B 혼합물은 신호 대 잡음비 및 감도 측면에서 더 높은 품질의 질량 스펙트럼을 생성했습니다. 특히, MALDI 타겟에 증착된 0.5피코몰의 단백질은 거의 검출할 수 없었지만, 동일한 양의 단백질은 거의 검출할 수 없었습니다.C-H-C-A-D-H-B 혼합물을 사용하는 SINO NIC 산을 사용하여 단백질의 다중 하전 이온이 관찰되었으며, 피크 분해능이 축방향 다중 toff 기기의 경우 마스터 전하 비율에 반비례하기 때문에 더 높은 정확도로 질량 측정이 가능했습니다. 또한, C-H-C-A-D-H-B 혼합물을 사용하여 매트릭스 증착을 위해 선택한 방법은 얇은 층 접근 방식이었습니다.

건조된 액적 방법을 사용하여 질량이 100킬로달톤보다 높은 단백질은 검출되지 않았습니다. 단량체 베타는 aase 단백질을 수집하고, 또한 멀티 TOF에 의해 분석하였다. C-H-C-A-D-H-B 스펙트럼은 감도와 분해능 측면에서 SINO NIC 산 스펙트럼보다 우수했습니다.

또한, 다중 하전된 이온의 존재는 더 높은 정확도로 단백질의 질량을 확인할 수 있게 했습니다. 온전한 면역글로불린을 분석하기 위한 MALDI가 여기에 나와 있습니다. C-H-C-A-D-H-B 혼합물을 사용하여 얻은 스펙트럼은 SA 및 알파 CHCA 스펙트럼보다 훨씬 더 강렬했습니다.

보다 구체적으로 말하면, 단백질 신호는 C-H-C-A-D-H-B 스펙트럼에서 더 높고 더 나은 분리능을 가졌습니다. C-H-C-A-D-H-B 혼합물과 박막 증착 방법의 사용은 큰 손상되지 않은 단백질의 품질을 크게 향상시키는 것으로 나타났습니다. MALDI를 사용하여 얻은 질량 스펙트럼.

제시된 프로토콜은 다중 기기를 사용하여 고분자량 단백질의 고품질 질량 스펙트럼을 획득하는 방법을 보여줍니다. 이러한 유형의 분석을 수행하는 동안 세 가지가 중요합니다. 먼저 새로 준비된 메트릭 솔루션을 사용합니다.

둘째, 말리 목표물에 샘플을 적절하게 보관하는 것입니다. 셋째, 레이저 강도와 같은 적절한 기기 설정을 사용합니다.