2.14: 제한 효소 분해

제한 효소 또는 제한 엔도뉴클레아제는 분자 생물학의 다양한 응용 분야에서 사용됩니다. 이 효소는 제한 부위(restriction site)라고 하는 특정 DNA 염기서열을 인식하고 절단합니다. 여러분이 시청하려고 하는 비디오는 이 기적적인 분자에 대한 몇 가지 배경 정보를 제공하고 제한 효소 분해를 설정하는 방법을 보여줍니다.

제한 효소는 어디에서 오는 것일까요? 이 효소는 박테리오파지(bacteriophage)로 알려진 바이러스에 대한 방어 메커니즘 역할을 하는 박테리아의 적응입니다. 박테리아 DNA의 제한 효소 부위에 메틸기를 추가함으로써 제한 효소는 파지 DNA만 인식하고 절단하여 감염을 예방합니다.

제한 효소는 꽤 이상한 이름을 가지고 있습니다. 예를 들어 HindIII, NotI, EcoRI 및 BamHI가 있습니다. 제한 효소 이름의 처음 세 글자는 분리된 유기체를 나타냅니다. 예를 들어, 제한 효소 EcoRI는 E. coli로부터 분리되었습니다. 필요한 경우 네 번째 문자는 효소가 분리 된 박테리아 균주를 나타냅니다. 로마 숫자는 그것이 그 특정 유기체에서 분리된 첫 번째, 두 번째, 세 번째 효소인지 여부를 나타냅니다.

제한 효소는 일반적으로 4-8개의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열을 인식하며, 이를 인식 부위(recognition site)라고 합니다. 염기서열 내의 특정 뉴클레오티드에서 효소는 DNA 골격의 포스포다이에스테르 결합을 끊습니다. 인식 부위는 일반적으로 회문(palindromic)이며, 이는 염기서열이 동일한 앞뒤로 읽힌다는 것을 의미합니다. 회문이 DNA 분자의 상보적 가닥에서 발견되면 역 반복 회문이라고 합니다.

제한 효소는 DNA가 절단되면 끈적끈적한 끝과 뭉툭한 말단과 같은 다양한 유형의 말단을 남길 수 있습니다. 끈적 끈적한 끝이 3을 남기나요? 그리고 5? 끝이 뭉툭한 동안 돌출부는 돌출부를 남기지 않습니다. 말단의 유형은 제한 효소 분해물에 의해 분리된 DNA 단편이 접합으로 알려진 과정에서 다른 DNA 단편과 재결합되는 방법을 지시합니다.

제한 효소 분해는 신중하게 계획해야 합니다. 소화 반응은 일반적으로 탈이온수, 절단될 DNA, 사용할 효소에 특이적인 완충액, 때로는 소 혈청 알부민 또는 BSA라고 하는 단백질로 구성됩니다. BSA는 효소가 소화물을 담고 있는 용기의 측면에 달라붙는 것을 방지하여 반응을 안정화합니다. 각 제한 효소는 잠재적으로 서로 다른 완충액 조건, 배양 온도 및 BSA 요구 사항을 가질 수 있습니다. 제한 효소 공급업체는 필요한 모든 정보를 얻기 위해 확인할 수 있는 리소스를 갖게 됩니다.

다이제스트 설정을 시작하려면 냉동실이나 냉장고에서 제한 효소를 꺼내십시오. 제한 효소를 얼음이나 내열 용기에 보관하여 향후 반응을 위한 최적의 활성이 있는지 확인하십시오. 마이크로분리관에 반응 성분은 다음 순서로 첨가해야 합니다. 먼저, 20μL의 최종 반응 부피를 생성하는 멸균된 뉴클레아제가 없는 물의 부피입니다. 그런 다음 10x 제한 효소 완충액, 필요한 경우 BSA, 최대 1μg의 DNA 및 2-10 단위의 효소. 단위는 37? 50에 C? L 반응 부피. 그 후, 볼텍싱으로 혼합한 다음 마이크로 원심분리기에서 12,000xg에서 잠시 원심분리하여 튜브 바닥의 내용물을 수집합니다. 그런 다음 제한 효소에 대한 최적의 온도(보통 37도)에서 배양합니까? C 가열 블록에서 1-4 시간 동안.

분해가 완료되면 반응 혼합물을 65에서 배양하는 것이 좋습니다. C는 제한 효소를 가열하여 비활성화합니다. 제한 효소는 대부분의 경우 특정 부위를 절단하지만, 배양 시간이 길어지면 일반적인 소화 부위와 비슷하지만 다른 부위를 절단하는 스타 활동으로 이어질 수 있습니다.

불활성화 후에는 DNA를 아가로스 겔에서 실행하여 절단이 성공적으로 이루어졌는지 확인해야 합니다.

다음은 다이제스트를 실행하고 성공을 보장하는 데 도움이 되는 몇 가지 유용한 팁입니다.

때로는 특정 DNA 단편을 생성하기 위해 여러 효소를 사용해야 하는 상황에 처할 수 있습니다. 이 경우 완충액 조건과 배양 온도가 두 효소 간에 호환되는지 확인해야 하며, 그렇다면 이중 분해를 수행하고 동일한 반응에서 두 효소를 절단할 수 있습니다. 그러나 때로는 두 효소 사이의 반응 조건에서 비호환성을 발견할 수 있으며, 이 경우 해결 방법은 효소를 순차적으로 사용하는 것입니다. 예를 들어, 분해는 먼저 하나의 효소로 수행될 수 있고, 그 다음에 완충액 조성은 두 번째 효소에 대해 최적이 되도록 변경될 수 있습니다. 완충액 비호환성을 극복하고 순차 분해를 수행하는 또 다른 방법은 초기 분해 후 DNA를 정제한 다음 두 번째 분해를 수행하는 것입니다.

컨트롤을 사용하면 다이제스트가 잘못될 수 있는 이유를 이해할 수 있습니다. 예를 들어, 효소가 없는 제어를 통해 DNA 샘플의 무결성을 확인하고 엑소뉴클레아제 활성이 존재하는지 확인할 수 있습니다. 알려진 제한 부위와 함께 대조군 DNA를 사용하면 효소의 활성을 테스트할 수 있습니다.

지금까지 분해가 어떻게 이루어지는지 살펴보았으니, 이제 제한 효소를 사용할 수 있는 다양한 방법을 살펴보도록 하겠습니다.

제한 효소는 특정 샘플을 식별하기 위해 진단적으로 사용할 수 있습니다. 다이제스트를 특수 칩에 로드한 다음 해당 칩을 바이오분석기라는 기계에 넣습니다. 연구원들은 물고기 샘플의 진위 여부를 결정하기 위해 다이제스트에 의해 생성된 DNA 단편 크기를 검사할 수 있습니다. 주어진 종 또는 이 경우 다른 종에서 동일한 유전자의 다른 밴딩 패턴을 제한 단편 길이 다형성이라고 합니다.

제한 효소는 또한 서브클로닝에 사용하여 한 플라스미드에서 DNA 단편을 분리하고 다른 플라스미드에 삽입할 수 있으므로 박테리아를 사용하여 원하는 단편을 복제할 수 있습니다.

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 또는 PCR을 사용하여 매우 특이적인 위치에서 유전자에 제한 부위를 도입함으로써, 제한 효소를 사용하여 동일한 유전자 또는 대립유전자의 대체 형태에서 단일 뉴클레오티드 차이의 존재를 확인할 수 있습니다. 이러한 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)은 PCR과 겔 전기영동만으로는 검출하기 어렵습니다. SNP 내에 제한 부위가 도입됨에 따라 간단한 다이제스트가 대립유전자를 구별할 수 있습니다.

당신은 방금 제한 효소에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 당신은 이러한 효소가 어디에서 왔는지 배웠고, 그들이 어떻게 작용하는지에 대한 몇 가지 기본 사항을 배웠고, 다이제스트를 설정하는 방법을 보았고, 분자 생물학에서 제한 효소가 어떻게 사용될 수 있는지 배웠습니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!