3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

다음 실험의 전반적인 목표는 3D 배양에서 암세포의 형태 및 세포외 기질과의 상호 작용을 관찰하는 것이며, 이는 먼저 3D 콜라겐 네트워크의 시각화를 허용하기 위해 적색 형광 DTRA가 있는 쥐꼬리 콜라겐을 라벨링하여 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 단일 세포 또는 다세포 스테로이드로 성장한 암세포가 3D Tamra 표지 콜라겐 매트릭스에 내장됩니다. 그런 다음 세포는 1-3일 동안 콜라겐 전체에 분산되어 생체 내에서 암세포가 주변의 3개의 DS 기질로 침입하고 이동하는 것을 모방합니다.

다음으로, 세포를 고정하고 적절한 항체와 Phin으로 면역 염색하여 관심 단백질의 세포 형태와 국소화를 시각화합니다. 궁극적으로, 3D에서 배양된 암세포의 독특한 형태와 3D 세포외 기질과의 상호 작용은 컨포칼 현미경으로 샘플의 딥 잭(deep Zacks)을 획득하여 분석할 수 있습니다. 이 방법은 수년 동안 2D로 분석된 3D 환경에서 분자 구성, 기능 및 세포 구성 요소의 위치 파악에 대한 더 나은 설명에 기여함으로써 세포 이동 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

저와 함께 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Anton Smo가 콜라겐 1에 Tamara를 표시하기 위함입니다. 1ml의 일회용 주사기에 1ml의 고농축 쥐꼬리 콜라겐을 천천히 채우는 것으로 시작합니다. 21 계기 피하 주사 바늘을 붙이고 그 후에 바늘을 가진 막을 손상하지 않기 위하여 주의하면서 10, 000 Dalton 단백질 분자량 커트오프를 가진 전 적신 3 밀리리터 투석 카세트에 교원질을 주사한다.

카세트에서 모든 공기를 제거하기 위하여 플런저를 뒤로 당기고, 그 후에 레테르를 붙이는 완충액의 1개 리터에 대하여 그 후에 교원질을 밤새 투석하십시오. 다음날 아침, 투석 카세트에서 콜라겐을 조심스럽게 제거한 다음 투석된 콜라겐 용액 1ml와 차갑게 희석된 Tamra 용액 1ml를 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 섞습니다. 튜브를 호일로 싸서 교대로 밤새 배양합니다.

다음날 아침 TAMRA에 의하여 레테르를 붙인 교원질을 전 적신 투석 카세트로 옮기고 과잉 염료를 제거하기 위하여 레테르를 붙이는 완충액의 1리터에 대하여 교원질을 밤새 투석하십시오. 그런 다음 Tamara에 의하여 레테르를 붙인 교원질을 보존하기 위하여는, 투석 카세트를 부피 당 0.2%volume의 1개의 리터, 4의 PH를 가진 아세트산 해결책으로 놓고 하룻밤 동안 카세트를 투석하십시오. 다시, 다음날 아침 투석 카세트에서 Tamara 표지한 교원질을 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 분리기 관으로 옮기고, 그 후에 교원질의 마지막 양을 측정하고, 그 후에 Tamara 상표가 붙은 교원질의 마지막 농도를 산출하십시오.

사용되는 콜라겐 용액의 초기 부피와 농도를 고려하여 DY 콜라겐을 섭씨 4도에서 저장하고 단일 세포를 내장하기 위해 빛으로부터 보호합니다. 밀리리터당 2밀리그램의 부피를 결정합니다. 실험에 필요한 Tamara 교원질 혼합은, 그 후에 10의 XPBS 및 1개의 정상적인 수산화나트륨의 적당한 양을 섞습니다.

그런 다음 Tamara 표지 콜라겐과 표지되지 않은 콜라겐을 1-6 비율로 적당량 혼합하여 밀리리터당 2mg의 최종 총 콜라겐 농도를 달성합니다. 이제 FBS가 없는 적절한 부피의 냉각 세포 배지에 관심 세포를 현탁시킨 다음 세포를 Terah 콜라겐 혼합물에 추가하여 10의 최종 세포 밀도를 10 곱하기 밀리리터당 5번째 세포를 얻습니다. pH 테스트 스트립에서 10 마이크로 리터의 혼합물을 테스트하여 pH를 확인한 다음 Tamara 콜라겐 세포 현탁액의 100 마이크로 리터 방울을 유리 바닥 접시에 피펫으로 넣어 콜라겐이 약 30-45 분 동안 흰색 젤로 변할 때까지 혼합물이 실온에서 중합되도록합니다.

그런 다음 콜라겐이 내장된 세포 방울을 덮을 수 있는 충분한 배양 배지를 조심스럽게 추가하고 세포가 매트릭스를 통해 이동할 수 있도록 충분한 시간 동안 방울을 10% 이산화탄소에서 섭씨 37도로 유지합니다. 일반적으로 세포 스테로이드를 삽입하는 데 1-3일이 소요됩니다. 피펫 : 갓 희석 된 테릭 콜라겐 100 마이크로 리터 방울.

유리 바닥 접시에 섞고 콜라겐이 2-5분 동안 중합을 시작하여 겔 점도를 약간 증가시키도록 합니다. 그런 다음 세포 스테로이드를 수집하여 신선한 페트리 접시에 놓습니다. 과잉 액체를 제거하고 세포 매체 내의 교원질의 희석을 방지하기 위하여 Tamara 교원질 혼합물의 10 마이크로리터에 있는 스테로이드를 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 P 20 피펫을 사용하여 콜라겐 현탁 스테로이드를 수집하고 100 마이크로 리터 TEMA 콜라겐 믹스 드롭 상단 중앙에 놓습니다. 콜라겐이 2-5분 동안 잠시 중합되도록 하는 것은 일반적으로 OID가 콜라겐 방울의 상단과 하단 모두에서 100미크론 이상 떨어져 있는지 확인하기에 충분합니다. 그러나 스테로이드가 여전히 가라앉는다면 접시를 약 2분 동안 뒤집은 다음 똑바로 세운 상태로 돌려보십시오.

콜라겐이 방금 설명된 대로 중합되도록 한 다음 콜라겐 스테로이드 방울을 덮을 수 있는 충분한 배양 배지를 조심스럽게 추가합니다. 그런 다음 세포가 면역형광 염색을 위해 매트릭스 전체로 이동할 수 있도록 방울을 배양합니다. 먼저 세포 배지를 조심스럽게 제거하고 스테로이드가 함유된 콜라겐 매트릭스를 PBS로 헹굽니다.

다음으로, 추출 고정 버퍼로 세포를 배양합니다. 5분 후 PBS에서 PFA와 자당으로 세포를 30분 동안 고정합니다. 그런 다음 세포를 헹굽니다.

이제 PBS에 희석된 1차 관심 항체로 세포를 배양합니다. 그런 다음 매번 30분 동안 매트릭스를 세 번 세척합니다. 세 번째 세척 후 2차 항체와 함께 매트릭스를 배양하고 Alexa는 PBS에 희석된 Phin 및 DPI를 접합했습니다.

그런 다음 매트릭스를 다시 세척 한 후 여분의 액체를 제거하고 접시 바닥을 채우는 약 500 마이크로 리터의 장착 매체를 추가합니다. 이제 24mm 커버 슬립으로 각 방울을 밀봉하고 방울을 눌러 매트릭스의 구조를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 샘플을 이미지화합니다.

40 x 대물렌즈를 콜라겐 드롭의 중앙에 놓습니다. 그런 다음 형광등을 사용하여 XY와 xz axi 모두에서 샘플의 개요를 확인합니다. 그런 다음 컨포칼 라이브 이미징 모드로 전환합니다.

561 나노미터 레이저를 사용하여 콜라겐 섬유가 나타나기 시작할 때까지 유리 바닥부터 초점을 맞추기 시작합니다. 이 깊이 Z가 0 마이크로미터와 같다고 가정합니다. 이제 Z가 0과 같은 100마이크로미터에 도달할 때까지 대물렌즈를 올린 다음 z에서 발견된 세포를 이미지화하여 100마이크로미터 이상이며 단단한 유리 바닥 라벨링 쥐 꼬리 콜라겐의 장력 효과를 피하면 Tamara가 있으면 3D 콜라겐 네트워크를 쉽게 준비하고 시각화할 수 있습니다.

느린 실온 중합을 통해 여기에서 빨간색으로 시각화된 이러한 네트워크의 형성을 통해 여기에서 파란색으로 표시되거나 여기에서 녹색으로 표시된 액틴과 같은 생체 내 세포골격 단백질에서 발견되는 것과 유사한 조직으로 3D 매트릭스에서 볼 때 이러한 이미지에서 볼 수 있는 것처럼 면역 염색으로 시각화할 수 있습니다. 결장 선암종 CT 26 세포는 Filip Podia 및 lam podia와 유사한 f 액틴이 풍부한 세포 돌출부로 끝이 뻗은 길쭉한 세포체를 특징으로 하는 전형적인 중간엽 형태를 나타냅니다. 이 길쭉한 형태는 콜라겐 기질에 침입하여 세포 스테로이드를 탈출하려고 시도하는 세포에서 훨씬 더 분명합니다. 배양에서 2 일 후에, 세포는 세포 스테로이드에서 멀어지는 교원질 3D 모체를 침범하기 시작합니다.

이러한 이미지에 있는 셀의 균일한 3D 분포를 보장하기 위해 모든 시야 평면에서 수집된 Z 스택을 분석하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 최대 XY 투영으로 시각화할 때 스테로이드로 성장한 CT 26 세포는 3D 콜라겐 매트릭스에 광범위하게 침입하는 것으로 보입니다. 그러나 x XZ 보기는 세포가 실제로 스테로이드 부피에 비해 제한된 Z 간격으로 침입하고 있음을 보여주며, 이는 우선적인 침입 영역을 암시합니다.

이 대표적인 스테로이드는 실제로 접시의 유리 바닥에 너무 가깝게 배치되어 세포가 스테로이드에서 멀어지는 것이 아니라 3D 콜라겐 매트릭스를 침범하지 않고 2D 단단한 유리에 크롤링하여 이 절차를 따랐습니다. TAMRA 콜라겐 매트릭스에 내장된 세포를 발현하는 GFP의 라이브 이미징과 같은 다른 방법은 세포와 매트릭스 간의 동적 상호 작용 또는 세포 유도 매트릭스 변형을 밀접하게 추적하는 데 사용할 수 있습니다.