근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

이 절차의 전반적인 목표는 골격근 손상 치료를 위해 정제되고 정지된 성인 뉴런 골격근 위성 세포를 이식하는 것입니다. 이것은 먼저 성체 마우스에서 골격근을 해부하고 효소로 골격근을 소화한 다음 자기 비드 분리에 의해 정지된 위성 세포를 분류함으로써 수행됩니다. 다음으로, 분리된 세포를 콜라겐으로 코팅된 배양 접시에서 확장하고, 마지막 단계에서 체외 확장 세포를 성체 마우스의 심장 토인 처리된 골격근에 주입합니다.

궁극적으로, 근육 섬유의 재생에 대한 체외 확장 위성 세포의 생착 및 기여는 xal 염색으로 평가할 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 스시 우라입니다. 저는 미네소타 대학의 줄기세포 연구소(Stem Cell Institute)의 부교수입니다.

집단 줄기세포 집단인 센트 위성 세포의 분리는 근육 줄기세포 생물학 및 재생뿐만 아니라 집단 뒤셴 근이영양증과 같은 근이영양증 치료를 위한 줄기세포 이식에 대한 이해에 필수적입니다. 기존 방법과 같은 사실에 비해 이 기술의 주요 장점은 우리의 방법이 성체 마우스 산란 근육에서 정지 위성 세포를 빠르고 경제적이며 신뢰할 수 있는 정제 방법이라는 것입니다. 시연 절차는 제 연구실의 하시 박사후 연구원인 Rio Moto와 Yoko Asura가 수행합니다.

생쥐의 골격근에서 단핵 세포를 분리하려면 먼저 3주에서 8주 된 안락사된 성체 생쥐의 복부 피부를 꼬집어 절단하는 것으로 시작합니다. 피부를 반대 방향으로 벗겨 삼두근과 뒷다리 근육을 완전히 노출시킨 다음 다리 뼈를 따라 다듬어 경골 전방, 위대퇴사두근 및 삼두근 골격근을 제거합니다. 근육을 10cm 접시에 담긴 얼음처럼 차갑고 멸균된 PBS로 옮기고 혈액을 씻어냅니다.

그런 다음 근육을 새로운 멸균 6cm 플레이트로 옮깁니다. 다음으로 실체 현미경으로 결합 조직, 혈관, 신경 다발을 제거하고 근육에서 후성적 조직을 추가합니다. 그런 다음 안과 가위를 사용하여 조직을 자르고 다져 부드러운 펄프를 만듭니다.

큰 조각을 남기지 않으려고 노력합니다. 다진 근육을 50ml 튜브로 옮기고 섭씨 37도의 콜라겐분해효소 용액 5ml로 조직을 소화합니다. 한 시간 후 18게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 조직 슬러리를 여러 번 트라이 샷합니다.

혼합물을 균질화하려면 균질산물을 15분 더 배양한 다음 혼합물을 다시 트라이 슬러리를 단일 세포 현탁액으로 해리하려면 최대 50ml의 배지를 추가하고 세포 용액을 혼합합니다. 그런 다음 70미크론 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 50ml 팔콘 튜브로 여과합니다. 수집된 세포를 세고 세포를 세척한 후 세포 현탁액을 스핀다운하고 펠릿을 200마이크로리터의 배지에 재현탁시킨 다음 세포를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 세포를 염색하고 분리합니다.

마이크로 원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓고 나열된 항체 본체 각각을 1마이크로리터로 세포에 배양합니다. 30분 후 1밀리리터의 배지로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 펠릿을 200 마이크로 리터의 배지에 재현탁시키고 얼음 위에 10 마이크로 리터의 안티 PE 마그네틱 비드를 세포를 배양합니다.

다시 30분 후, 최대 완충액 1ml로 세포를 두 번 세척하고 펠릿을 완충액 1ml에 재현탁합니다. 그런 다음 LD 컬럼을 자석에 놓고 컬럼을 1.5ml의 최대 버퍼로 헹굽니다. 세포 현탁액을 컬럼에 분배하여 1.5ml 튜브에서 PE 음의 흐름 스루 분획을 수집합니다.

그런 다음 PE 음의 분획을 스핀 다운하고 펠릿을 100 마이크로 리터의 매체에 재현탁시킵니다. 지금 얼음에 반대로 미국 IgG 자석 구슬의 5 마이크로리터에 있는 세포를 잠복시키고, 그 후에 30 분 후에, 완충기의 500 마이크로리터에 있는 펠릿을 중단하는 최대 완충액 2 시간 Resus의 1 밀리리터에 있는 세포를 세척하십시오. 다음으로, MS 컬럼을 자석에 놓고 1ml의 최대 버퍼로 헹굽니다.

그런 다음 세포를 컬럼에 분배하여 분획을 통한 알파 7 음의 흐름을 버립니다. 1ml의 최대 버퍼로 컬럼을 두 번 헹군 다음 자석에서 제거합니다. 그런 다음 플런저를 사용하여 컬럼을 통해 최대 완충액 1ml를 세척하여 자기적으로 표지된 인테그린 7개의 양성 세포를 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 용리시킵니다.

그런 다음 세포 현탁액을 스핀다운한 후 정제된 세포를 근아세포 배지에 재현탁합니다. 마지막으로, 5밀리리터의 근아세포 배지가 들어 있는 마트리겔로 코팅된 6cm 플레이트에 세포를 플레이트합니다. 세포 배양을 유지하려면 격일로 세포에 근아세포 배지 성장 근아세포를 공급합니다.

작은 둥근 모양을 나타내고 핵에서 myo D를 표현합니다. 세포 융합을 시작할 준비가 되면 PBS로 세포를 한 번 헹군 다음 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 트립으로 항아리를 만듭니다. 3분 후, 해리된 세포를 근아세포 배지에서 수집하고, 세포 리서스를 스핀다운하고, 근육세포 배지에서 펠릿을 현탁시키고, 세포를 새로운 마트리겔 코팅 플레이트로 재조립합니다.

세포 배양을 분화하려면 격일로 세포에 분화 배지를 공급합니다. 하루가 지나면 근아세포는 세포주기를 벗어나 미오신 중쇄 또는 MHC 양성 근세포로 분화를 거칩니다. 3일에서 5일째가 되면 세포는 서로 융합하여 다핵 근관을 생성합니다.

근아세포 이식 24시간 전에 진정제를 투여한 2개월 된 노드 스키드 마우스의 경골 전방 또는 TA 근육 주위의 털을 면도합니다. 그런 다음 31게이지 인슐린 주사기를 사용하여 10마이크로몰의 심장 토인을 근육에 주입합니다. 다음날, 방금 시연한 대로 트립신으로 마트리겔 코팅된 플레이트에서 증식하는 근아세포를 분리하고 해리된 세포를 스핀다운하여 50마이크로리터의 배지에 세포의 10배에서 6분의 1을 재현탁합니다.

그런 다음 세포를 31 게이지 인슐린 주사기에 넣고 TBI의 전방 근육 재생을 위해 세포를 수용 동물에 근육 주사로 이식합니다. 주사 후 1-4주 후에 조직학적 분석을 위해 TA 근육을 채취합니다. 갓 분리된 정지 위성 셀은 작은 둥근 모양을 나타내며, 이러한 셀의 90% 이상이 PAC 7을 결정적인 마커로 발현합니다.

생체 외 확장 근아세포는 근섬유 재생 및 위성 세포의 자가 재생에 대한 근아세포 기여도를 조사하기 위한 근육 내 세포 주입 실험에 활용될 수 있습니다. 분화 배지에서 배양되면 근아세포는 세포주기를 빠져나와 서로 융합하여 이식 후 며칠에서 수개월 후에 미오신 중쇄를 발현하는 다핵 근관이 됩니다. 증식하는 근아세포, 자가 재생 위성 세포 및 새로 형성된 근섬유를 포함하는 베타 갈락토 측 양성 기증자 유래 세포는 각 발달 후 심장 토인 손상 근육에서 검출될 수 있습니다.

이 기술은 근육 줄기 세포 및 근육 기원 분야의 연구자들이 근이영양증에 대한 줄기 세포 이식을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 저는 요코입니다. 저는 노리오입니다.

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