피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

동적 길이 이미징 및 기자 형질 전환 생쥐의 신경 종말의 선택적 레이저 병변에 대한 프로토콜은 제공됩니다.

다음 절차의 목적은 선택적 병변 후 피부의 신경 말단에서 종방향 동적 변화를 연구하는 것입니다. 이를 위해 YFP 형질전환 마우스를 마취하고 발열 패드에 올려 체온을 유지합니다. 뒷발을 플라스틱 포장재에 놓고 피부에 물 한 방울을 떨어뜨리면 더 나은 광학 결합을 얻을 수 있습니다.

안정성을 위해 금속 막대에 단단히 부착된 유리 커버 슬립으로 뒷다리를 덮습니다. 침수 대물렌즈를 위해 물 한 방울을 넣고 현미경 이미징을 2중 수행합니다. 신경 말단의 레이저 유도 병변과 결합하여, 다양한 병리학적 상태가 피부 통합의 역학에 영향을 미칩니다.

이 효과를 확인하는 가장 좋은 방법 중 하나는 살아있는 동물의 피부 내에서 직접 피부 신경 말단의 병리학적 변화를 시각화하는 것입니다. Vivo to photo microscopy는 이러한 접근 방식을 위한 훌륭한 도구입니다. 이미징 전에 마우스의 무게를 측정하고 체중 en xylazine의 80 마이크로 그램 pergram의 농도로 케타민을 주입하여 마취를 유도합니다.

10 마이크로 그램 pergram의 농도에서 체중. 마우스의 뒷다리를 살짝 꼬집어 마취를 확인합니다. 점성이 있는 안약을 사용하여 마우스 눈의 탈수를 방지하십시오.

안정화를 위한 이미징 중에는 링이 있는 독점적인 디자인의 금속 고정 장치를 사용합니다. 링에 작은 접착제 한 방울을 놓고 균일하게 펴십시오. 그런 다음 덮개 유리를 금속 링에 부착합니다.

이미징을 위해 마우스 피부를 균일하게 커버할 수 있도록 당사는 전동 스테이지가 장착된 시판되는 2광자 현미경을 사용합니다. 우리는 현미경 스테이지에 단단히 부착된 단단한 금속 막대에 커버 유리가 아래를 향하도록 금속 링을 고정했습니다. 우리는 동물을 발열 패드에 보관하여 동물의 체온을 섭씨 37도로 유지합니다.

뒷부분을 에탄올로 청소하십시오. 침지를 위해 피부 표면에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 유리 커버 슬립과 플라스틱 포장재 사이에 Hein 폴을 놓습니다.

뒷발의 최상의 위치를 얻기 위해 재료를 조정하십시오. 대물렌즈가 잠길 수 있도록 유리 위에 물 한 방울을 추가합니다. 목표 아래에서 고정된 뒷발로 스테이지를 운전하십시오.

먼저 에피 형광 램프를 사용하여 데이터 수집에 적합한 영역을 찾습니다. 관심 있는 신경 말단을 찾고 동일한 영역에서 반복 측정을 위해 좌표를 기록합니다. 적절한 신경에 초점을 맞추면 두 광자 모드로 전환할 수 있습니다.

사진 승수 튜브에 적절한 전압을 설정합니다. 일반적으로 500픽셀에서 800픽셀 사이의 이미지 크기를 선택하고 여기 파장을 설정합니다. 예를 들어, YFP의 경우 915나노미터입니다.

이미지 스택을 획득한 후 병변 절차로 이동합니다. Olympus 소프트웨어 패키지에서 사용할 수 있는 표백 루틴을 사용하고 노출 시간을 100밀리초에서 1초 사이로 설정합니다. 각 특정 피부 부위의 광학적 특성에 따라 다릅니다.

병변을 만들고 싶은 지점을 찾아 미백 루틴을 켜십시오. 병변 후 몇 분, 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 이미징에서 타임 랩스를 사용하여 변경 사항을 추적합니다. 일반적으로 이미지 세션의 지속 시간은 약 1시간이지만 작업에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.

측정 후, 우리는 마우스로 대물렌즈에서 멀리 떨어진 스테이지를 운전합니다. 마우스가 깨어날 때까지 섭씨 37도의 온도로 설정된 복구 상자로 마우스를 가져옵니다. 그런 다음 이미징 절차를 며칠 또는 몇 달에 걸쳐 반복할 수 있습니다.

오프라인 분석 과정에서 중첩 차수 형광에서 YFP 형광과 같은 관심 신호를 UNIX해야 하는 경우가 있습니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 스펙트럼 불혼화를 수행합니다. 이미지 스택을 열고 채널을 분할합니다.

신경 종말이 있는 영역이 머리카락이나 다른 구조와 명확하게 구별될 수 있는지 확인하십시오. 당신은 그것을 유닉스하고 싶습니다. spectral 및 mixing이라는 플러그인을 사용하여 unmixing 행렬의 매개변수를 계산합니다.

먼저 배경 잡음 수준을 측정할 신호 없음 영역을 찾습니다. 그런 다음 신경 말단과 구별할 수 있는 털 부분의 윤곽을 주의 깊게 그려 넣으십시오. 더 정확하게 선택할수록 더 나은 분리가 가능합니다.

그런 다음 신경 말단의 한 부위를 정확하게 윤곽을 그리십시오. 마지막으로 동일한 플러그인을 사용하고 얻은 행렬을 적용하여 데이터를 혼합하지 않습니다. 이제 모발 신경이 두 개의 다른 채널에 나타나야 합니다.

그 결과, 신경 섬유의 3차원 구조를 재구성하고 시간 경과에 따른 변화를 추적할 수 있습니다. 몇 분에서 며칠, 심지어 몇 달까지 다양한 시간 척도를 사용할 수 있습니다. 또한, 예를 들어 미토콘드리아에서 형광 마커를 발현하는 것과 같은 다른 형질전환 마우스 라인을 사용할 수 있습니다.

생체 내에서 적절한 형질전환 모델과 결합된 표면 구조의 다중 사진 현미경은 생리학적, 병태생리학적 과정과 피부를 연구하는 강력한 도구입니다. 이 비디오 프로토콜에서 시연한 방법론적 접근 방식은 간단하고 신뢰할 수 있으며 비침습적인 방식으로 설치류 계획에서 말초 신경에 대한 다중적 현미경 이미징 및 미세 수술 조작을 수행할 수 있는 몇 가지 필수 팁을 공개합니다. 이 방법은 사용 가능한 다양한 형질전환 형광 모델에 쉽게 적용할 수 있기 때문에 이 비디오가 표면 이미징 실험을 수행하는 다른 연구자들에게 도움이 되기를 바랍니다.

시청해주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.I.