November 19th, 2013
이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 온전한 성인 제브라피쉬의 뇌에서 신경 활동에 대한 생체 내 기록을 얻는 것입니다. 이것은 먼저 Trica Methyls sulfonate의 목욕 적용을 통해 고정되지 않는 성인 얼룩말 물고기를 얻음으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 움직이지 못하는 얼룩말 물고기를 삽관하는 것입니다.
다음으로, 뇌에 접근할 수 있도록 trica 마취 하에 개두술을 시행합니다. 마지막 단계는 개두창 내에 1차 전극을 배치하여 세포 외 뇌 활동을 기록하는 것입니다. 궁극적으로 생체 내에서.
성체 제브라피쉬의 전기생리학은 다양한 약리학적 화합물 또는 유전적 돌연변이가 어떻게 제브라피쉬의 고유한 신경 활동에 변화를 일으킬 수 있는지 보여주는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 뇌 구조의 변화가 정상적인 발달과 유전적 돌연변이의 경우 모두에서 신경 활동의 변화에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 발달 생물학과 신경 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 뇌 조직을 손상시키지 않고 머리를 덮고 있는 뼈판의 작은 부분만 제거하기 위해 각별한 주의를 기울여야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
삽관 캐뉼라는 물고기에 액체가 유입되는 것을 용이하게 합니다. 이 설정은 캐뉼라를 동물의 입 안에 가장 잘 배치할 수 있는 유연성과 견고성을 모두 제공합니다. 이 설정의 경우 가위나 면도날을 사용하여 P 200 피펫 팁의 넓은 끝에서 1.5cm 부분을 제거합니다.
그런 다음 6cm x 1mm 크기의 튜브 조각을 감압 밸브에 삽입합니다. 그런 다음 수정된 피펫 팁을 직경 튜브의 1/8 부분의 짧은 부분에 삽입합니다. 그런 다음 튜브를 사용하여 캐뉼러를 피펫 팁에 삽입하여 피펫 팁을 루어 잠금 장치로 제자리에 고정할 수 있습니다.
실험하기 전에 서식지 물로 풍성한 설정을 세척하여 모든 기포가 제거되었는지 확인했습니다. 다음으로, 30ml의 630마이크로몰 트리카 용액을 개두술 관류 설정에 추가하고, 그 중 2밀리리터가 튜브를 통과하도록 하여 풍부 시작 시 동물에게 트리카가 전달되도록 합니다. 주요 풍부 설정의 경우 첫 번째 튜브에 50ml의 서식지 물을 추가합니다.
그런 다음 나머지 튜브 각각에 원하는 실험 화합물을 추가합니다. 그런 다음 삽관 베이스의 작은 구멍에 캐뉼라 설정을 놓고 1인치 너비의 Kim 와이프 스트립을 단단한 나선형으로 비틀고 Kim 와이프가 양쪽 끝으로 확장되도록 배액 튜브에 삽입합니다. 이 조직은 관류된 액체를 제거하고 전기 생리학적 기록을 방해할 수 있는 삽관 바닥 내에 액체가 축적되는 것을 방지하는 심지 역할을 합니다.
다음으로, 튜브의 한쪽 끝을 페트리 접시의 큰 구멍에 삽입하여 아래쪽 끝이 모든 풍부한 폐기물을 모을 수 있을 만큼 충분히 큰 불활성 접시로 확장되도록 합니다. 이 접시는 설치의 유출 저장소 역할을 합니다. 그런 다음 한쪽 끝이 동물의 복부 근처에 있고 아래쪽 확장이 접시에 떨어질 수 있도록 조직을 배치합니다.
이 완성된 삽관 베이스를 해부 현미경 근처에 놓습니다. 그런 다음 캐뉼라의 lu lock을 trican profusion 튜브에 연결합니다. 이 절차에서는 630 마이크로 몰 트리카 용액을 15 x 60mm 페트리 접시에 최대 3/4까지 추가합니다.
다음으로 밭 접시의 무게를 잰다. 이것은 동물을 움직이지 못하게 하여 추가 마취를 복막에 주입할 수 있도록 하는 데 사용됩니다. 이제 트리카가 들어있는 접시에 동물을 담그고 접시의 무게를 다시 잰다.
그런 다음 총 무게에서 채워진 접시의 무게를 빼서 물고기의 무게를 계산합니다. 동물이 진정되고 대부분의 움직임이 멈출 때까지 트리카 용액에 동물을 그대로 두십시오. 물고기가 트리카 용액에 잠겨 있는 동안 34게이지 바늘이 들어 있는 NFI 주사기를 사용하여 물고기 무게 1g당 1마이크로그램이 되도록 충분한 판토늄 브로마이드를 빼냅니다.
물고기가 진정되면 한 쌍의 넓은 집게를 사용하여 꼬리로 물고기를 미리 적신 스폰지로 옮기고 옆으로 놓습니다. 다음으로 스펀지와 물고기를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 아이스 캔디 스틱으로 물고기의 등쪽을 잡습니다.
그런 다음 pan keon bromide interperitoneal을 투여합니다. 이제 가는 집게를 사용하십시오. 아래턱으로 물고기를 잡고 재빨리 삽관 기지로 옮기세요.
1mm 캐뉼라를 입에 삽입할 수 있도록 동물의 등쪽이 위로 향하게 놓습니다. 다음으로, 가는 집게를 사용하여 물고기를 움직이고 캐뉼라 주위의 입을 엽니다. 우리의 설정에서.
베이스에 스톱이 설계되어 캐뉼라가 물고기의 입에 3mm 삽입될 수 있습니다. 제자리에 고정되면 trica가 포함된 중력 공급 관류 튜브를 켭니다. 그런 다음 Kim 물티슈의 3제곱센티미터 부분을 잘라 서식지 물과 결합합니다.
건조를 방지하기 위해 동물 위에 조직을 놓습니다. 해부 현미경 아래에서 물고기는 준비를 하고 개두술이 수행되기를 기다립니다. 이 영역은 눈 뒤에 있는 어두운 뼈 판처럼 보입니다.
다음으로, 접시 가장자리에 가위 밴의 칼날 하나를 삽입하고 뇌를 관통하지 않고 뼈를 관통 할 수있는 충분한 힘으로 밀어 넣습니다. 그런 다음 가위를 닫아 뼈를 자릅니다. 그런 다음 전기 생리학 기록을 위해 뼈 조각을 제거합니다.
삽관을 끕니다. 수탉을 멈추고 삽관 베이스를 trica drip에 연결하는 루어 잠금 장치를 빠르게 분리하십시오. 온전한 삽관 설정을 전기생리학 현미경으로 옮기고 관류 시스템에 연결합니다.
서식지를 켜고 물을 주고 약 1시간 동안 분당 1밀리리터의 속도로 관류합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 트리카를 씻어내려면 전극 팁이 동물의 콧구멍이나 위턱 아래의 딥에 삽입될 수 있도록 보조 전극을 배치합니다. 그런 다음 1차 전극 바늘을 개두구 구멍에 삽입합니다.
그런 다음 바늘 끝을 시신경 텀 내에서 상당히 표면적으로 위치하도록 조직에 바늘을 삽입합니다. 전극의 더 깊은 위치는 0.1 킬로 헤르츠의 저역 통과 필터 및 1 헤르츠의 고역 통과 필터와 함께 5, 000 헤르츠 샘플링 속도에서 데이터 수집 갭 프리 모드를위한 작은 전기 신호가 사용될 수 있습니다. 서식지 물이 최소 45분 동안 관류되었을 때 전기 생리학적 활동의 기록을 시작합니다.
실험 약물을 추가하기 전에 최소 15분 동안 기본 활성의 기준선을 기록합니다. 이 실험에서는 성체 제브라피쉬의 토착 신경학적 활동을 모니터링했으며, 이 그림은 기록 기간 동안 약 2-10밀리볼트의 작은 진폭을 가진 시신경 텀의 자발적인 기준선 활동을 보여줍니다. 15밀리몰 PTZ가 시스템에 도입된 후 방전과 같은 자연 간질 형태가 5분 이내에 발생하기 시작했습니다.
PTZ에 지속적으로 노출되면 최대 15밀리볼트의 일관된 패턴, 큰 진폭 방전, 더 작고 더 빈번한 활동 폭발이 이어졌습니다. 이 절차를 수행하는 동안 동물을 다루고 개두술을 수행하는 동안 인내심을 갖고 시간을 할애하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 온전한 성인 제브라 피쉬의 뇌에서 신경 활동에 대한 생체 내 기록을 얻는 방법에 대한 좋은 아이디어를 얻을 수 있을 것입니다.
이것은 풍력 시스템을 사용하고 움직이지 못하는 동물에게 개두술을 수행함으로써 이루어집니다.
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이 논문은 성체 제브라피쉬의 뇌에서 신경 활동의 in vivo 기록을 얻는 절차를 설명합니다. 이 방법은 전기생리학적 실험을 위해 뇌에 접근하기 위해 고정, 삽관, 개두술을 포함합니다.
In vivo electrophysiological recording in intact adult zebrafish enables direct measurement of neural activity under physiologically relevant conditions, supporting mechanistic de-risking in neuropharmacology and genetic studies. This approach bridges the gap between larval and adult models, enhancing predictive confidence for target validation and compound evaluation in CNS drug discovery. The method's ability to monitor real-time neural responses to pharmacological agents positions it as a critical tool for early-stage portfolio triage and translational research.
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical evaluation, particularly for CNS and neuroactive portfolios.