자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

HIV 약물 내성은 HIV 전염병을 통제하기 위한 노력의 진전을 좌절시킬 가능성이 있습니다. 따라서 미숙한 환자와 치료에 실패한 환자에 대한 약물 내성을 지속적으로 조사하고 모니터링하는 것이 중요합니다. 불행히도, 현재 사용되는 대부분의 방법은 특히 사하라 사막 이남 아프리카의 HIV 전염병의 규모와 관련하여 구현하는 데 비용이 많이 듭니다.

여기에서는 HIV 약물 내성 유전형 분석을 위한 저비용 개방형 접근 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 4단계로 나뉩니다. RNA 추출, 최고의 전사 및 PCR 염기서열분석 및 생물정보학.

H-I-V-R-N-A는 KaiGen 바이러스 RNA 키트를 사용하여 추출됩니다. 이 방법은 열을 사용하여 침전된 침전물을 트랩하고 청소합니다. 이 단계의 RNA에는 항상 양성 대조군과 음성 대조군이 포함됩니다.

시작하기 전에 필요한 각 영역의 부피를 계산합니다. 처리 중인 샘플의 수에 대해서는 항상 영역 컨트롤을 추가하는 것이 좋습니다. 추출된 positive 및 negative control 외에도 0.5μl의 primer RT 21 및 0.5μl의 DNTP 혼합물을 깨끗한 멸균 200μl PCR 튜브에 첨가하여 DNTP 프라이머 혼합물을 준비한 후 간략하게 준비합니다.

과세를 위해 10배 완충액 1마이크로리터, 3.1몰 DTT 1마이크로리터, 25밀리몰 2마이크로리터를 첨가하여 t 효소 혼합물을 준비합니다. 멸균 튜브에 염화 마그네슘은 각 효소, RNA 출력 및 s 스크립트를 0.5 마이크로 리터 추가합니다. 셋째, 효소 믹스 튜브로 역전사체를 전달한 후 부드러운 혼합을 수행합니다.

코드 블록에 덴트 p 프라이머 믹스와 효소 믹스가 있는 튜브를 유지하고 RNA의 RNA 스테이션 토르로 이동하여 DNTP prima mix 튜브로 이동합니다. RNA를 추가한 후 카드 블록에 모든 튜브가 있는 PCR 실로 이동하여 DNTP 1차 RNA 혼합물을 피난처로 만들고 열순환기 열에 넣습니다. 섭씨 5도에서 5분 동안 제외하고 섭씨 4도까지 급속히 냉각합니다.

2분 동안 유지합니다. 섭씨 4도에서 2일 동안 열순환기를 일시 중지합니다. 튜브를 꺼내고 코드 블록 믹스에 튜브를 유지하면서 5마이크로리터의 효소 혼합물을 첨가한 다음 간단히 원심분리하고 열 순환기로 돌아갑니다.

튜브를 섭씨 50도에서 60분 동안 유지한 다음 섭씨 85도에서 5분 동안 유지합니다. 섭씨 37도까지 식히십시오. 그리고 이 온도에 도달하자마자 일시 중지하십시오.

thermocycler에서 튜브를 빠르게 꺼냅니다. 열린 5마이크로리터의 RNA 가장자리를 튜브에 추가하고 열 사이클을 되돌립니다. 섭씨 37도를 20분 동안 유지한 다음 시작하기 전에 섭씨 4도를 코드화합니다.

처리 중인 샘플의 수와 대조군, 그리고 세 가지 대조군(positive, negative, reagent) 외에 필요한 각 영역의 부피를 계산합니다. 첫 번째 및 두 번째 라운드에 PCR 컨트롤을 추가할 수도 있습니다. PCR 믹스는 동시에 두 번째 마스터 믹스를 준비할 수 있습니다.

셋째, 필요할 때까지 학점 학위 출처를 뺀다. 믹스는 최대 8시간 동안 보관할 수 있습니다. 표에 표시된 입 안에 물 10 배 완충액, 염화마그네슘, DTP 및 프라이머를 추가합니다.

그리고 소용돌이. 0.1 마이크로리터의 백금 태그 중합효소를 추가하고 23 마이크로리터의 마스터 믹스 초기 코드를 200 마이크로리터 PCR 튜브에 코드 블록의 마스터 믹스 튜브와 부드럽게 혼합합니다. PCR실로 이동합니다.

1차 PCR 마스터 믹스 23마이크로리터에 2마이크로리터의 CDNA를 첨가합니다. 관을 닫고, thermocycler에 있는 표본을 끼워넣고 계속된 PCR 프로그램을 달리십시오. 2차 PCR 단계 또는 1차 PCR 산물을 필요할 때까지 섭씨 영하 20도 이하에서 보관하십시오.

2차 PCR의 경우, 2차 PCR 마스터 믹스 23마이크로리터에 1차 PCR 산물 2마이크로리터를 첨가하고 동일한 PCR 프로그램을 사용하여 PCR 증폭을 평가합니다. 40분 동안 800볼트와 400단어의 전기영동 1%를 수행합니다. 포지티브 증폭은 단편당 1, 315 염기로 시각화할 수 있습니다.

염기서열분석 반응을 준비하기 위해 negative 및 시약 대조군에서 증폭이 없어야 합니다. 양성 2차 PCR 산물이 정리됩니다. pure link PCR 정제 키트를 사용하여 20마이크로리터의 PCR 산물 및 피펫 혼합물에 80마이크로리터의 결합 완충액을 추가합니다.

벤딩 버퍼와 혼합된 샘플을 수집 튜브의 순수 링크 스핀 컬럼에 추가합니다. 10, 000 RCF에서 1분 동안 컬럼을 원심분리하십시오. 컬럼을 새 수집 튜브로 옮깁니다.

650마이크로리터의 세척 버퍼 원심분리기로 컬럼을 세척합니다. 10, 000 r에 란은 1 분 동안 저장한다. 컬럼을 새 수집 튜브로 옮깁니다.

F를 열, 최대 속도는 2-3분 동안 사용합니다. 깨끗한 1.7ml 엘루시안 튜브에 스핀 컬럼을 놓습니다. 컬럼 중앙에 40마이크로리터의 엘루시안 완충액을 추가하고 실온에서 1분 동안 컬럼을 배양합니다.

2-3분 동안 최대 속도로 컬럼을 원심분리합니다. 엘루시안 튜브에는 염기서열분석 준비가 된 정제된 PCR 산물이 들어 있습니다. 열을 버립니다.

PCR 산물은 각 프라이머에 대해 각 샘플에 대해 큰 D 종결 키트 버전 3.1 및 4개의 프라이머를 사용하여 염기서열분석됩니다. 표에 표시된 대로 염기서열분석 반응을 설정합니다. 튜브를 일찍 침입하여 마스터 믹스를 부드럽게 혼합했습니다.

96 휠 플레이트에 9 마이크로 리터의 마스터 믹스를 잡았습니다. 하나의 플레이트는 24개의 샘플을 실행합니다. 각 열이 2개의 샘플과 1마이크로리터의 DNA 샘플을 수용하는 아래 레이아웃을 사용할 수 있습니다.

플레이트를 덮고 3000 RCF에서 원심분리기를 1분 동안 부드럽게 섞습니다. 플레이트를 써모사이클러에 놓고 PCR이 끝나는 곳에서 사이클링 프로그램을 실행합니다. 염기서열분석 산물을 즉시 세척하십시오.

염기서열분석 반응의 부산물과 과도한 오염 물질은 염기서열분석 전기영동을 방해할 수 있습니다. 따라서 자동 형광 DNA 염기서열분석 전기영동을 위해 샘플을 로드하기 전에 염기 분석 제품을 세척하여 과도한 전제와 통합된 d 종결인자, 염 및 효소를 제거하는 것이 중요합니다. 여기에 사용된 방법은 간단한 e 에탄올 나트륨 ASCE 프로토콜로, 각 염기서열분석 반응에 대한 프로토콜은 50마이크로리터의 절대 에탄올과 5마이크로리터의 3몰 나트륨산을 만듭니다.

준비된 다중 채널을 사용하여 5 마이크로 리터의 나트륨 산 에탄올 용액을 각각에 첨가하십시오. 접착 호일로 웰을 밀봉하여 각 웰이 적절하게 재봉되고 와류가 3000RCF에서 20분 동안 원심분리기를 혼합하도록 합니다. 20분 후 덮개를 제거하고 한 번의 부드러운 동작으로 플레이트를 앞으로 쳐 닦습니다.

150 RC에서 2분 동안 거꾸로 된 플레이트를 즉시 퍼징하고, 동일한 접착 호일 커버와 3000 RCF에서 5분 동안 와류 원심분리기를 사용하여 이 단계 씰에서 에탄올 추가를 지연하지 않도록 150마이크로리터의 코드 에탄올을 추가합니다. 접힌 화학요법 보수판과 원심분리기 뒤집힌 플레이트를 150 RCF에서 1분 동안 열순환기에 담아 뒤집어 섭씨 50도에서 건조시킨다. 건조되면 접착 호일 덮개로 장소를 밀봉하고 호일로 싸서 섭씨 영하 20도에서 보관하고 염기서열분석 전기영동을 진행할 준비가 될 때까지 보관합니다.

염기서열을 분석할 준비가 되면 아미드 변성을 위해 용해하고 전기영동을 위해 31 30 유전자 분석기에 로드합니다. 천재 프로그램을 시작하십시오. 로컬 문서 안에 작업 폴더를 만들어 시퀀스를 저장합니다.

시퀀싱 기계에서 생성된 A BF 파일을 genius 작업 폴더로 가져옵니다. 가져오기 도구를 사용하여 genius는 각 시퀀스에 대한 백분율 품질 점수를 할당합니다 품질 점수가 70% 이상인 가져온 열린 시퀀스를 두 번 클릭하면 각 파일이 새 창에서 열립니다. Genius는 연한 파란색 버즈를 사용하여 염기서열의 각 뉴클레오티드 위치를 나타냅니다.

바가 높을수록 최고 점수의 품질이 좋아집니다. er을 사용하여 끝을 제외한 시퀀스의 중간 부분을 선택합니다. extract 버튼을 클릭하여 고품질 염기서열로 영역을 추출합니다.

각 샘플에 대해 추출된 4개의 염기서열을 모두 선택하고 Annotated reference sequence에 대해 조합합니다. 조립된 시퀀스를 검사하여 올바른 판독 프레임에 있는지 확인하십시오. 올바른 판독 프레임에 있는 경우 하위 유형 c 프로테아제의 시작은 다음과 같이 시작해야 합니다. 아멘.

산 P-Q-I-L-W-T. RT의 시작은 P-I-S-P-I-A로 시작하여 300번째 RT 코드의 시작을 포함하는 CONT 영역을 추출합니다. 이 과정에서 삽입 또는 삭제 여부도 확인하십시오.

추출된 conti의 합의 순서를 살펴보면서 모호성을 식별하고 기저의 측면 영역의 품질 대칭 높이, 배경 및 어깨를 검사하여 혼합된 염기가 있는 위치를 확인합니다. 합의 순서를 선택하고 추출 버튼을 클릭하여 네 가지 전제에서 생성된 합의 순서의 별도 파일을 만들고 적절하게 레이블을 지정합니다. 시퀀스를 컴퓨터 또는 네트워크의 백업 스토리지 폴더에 노출합니다.

H HIV V DB program@hivdb.stanford.edu 를 사용하여 염기서열을 분석합니다. 삭제 여부를 확인하고 해당 세션에서 ARI 데이터를 확인합니다. 이 시퀀스는 300단계 RT 코드의 99개 시위 코드를 모두 다룹니다.

RT 지역의 두 시위에서 강조 표시된 QA 문제(예: 상단 코드, 프레임 이동, 모호한 위치 및 비정상적인 잔여물)와 이전 실행의 로컬 시퀀스 데이터베이스에 대한 새 시퀀스를 확인합니다. 새 염기서열이 데이터베이스의 염기서열과 97% 이상 유사한 경우 프로토콜의 모든 단계를 검토해야 합니다. 염기서열 분석부터 시작하여 RNA 추출로 돌아가 혼합이나 오염이 없는지 확인합니다.

문제가 확인되지 않으면 염기서열이 여전히 97%유사보다 큰 경우 이전 샘플과 새 샘플을 모두 다시 시퀀싱합니다. 환자 병력을 검토하여 환자 간의 역학적 연관성을 평가합니다. 이것은 또한 오염을 식별하는 데 사용되는 또 다른 품질 도구입니다.

역학적으로 연결된 환자의 간단한 혼합 또는 샘플. Cluster W 프로그램을 사용하여 데이터베이스의 모든 시퀀스를 정렬합니다. Ingenious는 정렬에서 잘못 정렬된 시퀀스, 삭제 및 세션을 수동으로 확인하고 그에 따라 편집합니다.

Genius three builder 또는 다른 독창적인 나무 빌더를 사용하여 계통 발생 나무를 구성하십시오. 나무에서 가지가 짧은 표본을 조사합니다. 분기 길이가 짧은 샘플을 검토하여 오염 가능성을 확인합니다.

드롭다운 메뉴에서 고유한 사용자 이름과 비밀번호를 사용하여 REGAR DB에 로그인합니다. 환자 ID에서 환자 ID로 시작을 선택하고 메뉴에서 박수를 보낼 순서의 환자를 선택합니다. 오른쪽으로, viral 아래의 옵션에서 viral isolate를 선택하고 추가를 선택합니다.

샘플 날짜, 샘플 ID, 시퀀스 ID 및 염기서열 분석 날짜를 입력합니다. 파일 선택을 선택한 다음, 박수를 받을 더 빠른 파일로 이동합니다. 박수를 보낼 더 빠른 파일을 선택한 후 박수를 클릭하십시오.

CLE 상자에 박수 시퀀스가 나타나면 창 오른쪽 아래에 있는 확인 버튼을 클릭합니다. rt에서 농산물을 확인하십시오. 단백질을 클릭하고 PR 또는 rt를 선택하여 냄비 정렬.

내성 패턴을 사용하여 약물 내성 돌연변이를 확인합니다. 이를 통해 A NRS, Stanford, HIV DB 및 rega db의 세 가지 알고리즘에서 내성 프로파일을 얻을 수 있습니다. 바이러스 분리 보고서 탭을 클릭합니다.

유전자형 해석을 위한 알고리즘과 사용할 보고서 템플릿을 선택합니다. 알고리즘과 템플릿이 선택되면 generics를 클릭합니다. 생성된 RTF 문서를 다운로드합니다.

RTF 문서를 워드 문서로 엽니다. 암송 치료 이력 차트 뒤의 차트, A, 섹션 임상 차트 및 내성 해석. 환자의 치료 이력과 바이러스 내성 프로파일에 대한 설명을 추가합니다.

또한 환자의 바이러스 부하에 대한 설명과 CD 4 프로파일을 추가합니다. 미래 환자 관리에 대한 검토 및 권장 사항을 위해 전문가를 추가하려면 보고서를 보냅니다. 이 프로토콜의 전체 비용 절감은 네 가지 전략을 통해 달성되었습니다.

첫 번째는 거의 모든 단계에서 반응량을 줄여 시약을 보다 효율적으로 사용할 수 있도록 하는 동시에 염기서열 품질을 유지하는 것이었습니다. 둘째, 염기서열분석 프라이머의 감소입니다. 대부분의 프로토콜은 6-8개의 프라이머를 사용하여 역전사 유전자의 첫 번째 1/3에 있는 단백질 유전자를 포함하는 빈약한 영역, 4개의 프라이머 세트를 사용하거나 최종 서열의 품질을 손상시키지 않고 동일한 영역을 시퀀싱하도록 선택하여 적어도 1/3로 인한 염기서열 분석 단계를 줄입니다.

셋째, 기술 분석 및 보고서 생성을 위해 대부분 무료 오픈 액세스 소프트웨어 및 프로그램을 사용하여 비용을 더욱 절감할 수 있었습니다. 마지막으로 단체 교섭 및 공공-민간 파트너십입니다. 남아프리카 치료 및 저항 네트워크(Southern African Treatment and Resistance Network)의 회원들이 이 프로토콜의 모든 구성 요소에 대해 할인된 가격을 받을 수 있도록 할인된 가격이 협상되었습니다.

이들은 또한 그의 접근을 위한 키트에 관심을 가졌습니다.