성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

이 절차의 전반적인 목표는 성체 제브라피시 질병 모델에 적용할 수 있는 정량적 측선 재생 분석을 개발하는 것입니다. 이것은 먼저 성체 얼룩말 물고기의 측선을 Gentamycin으로 24시간 동안 처리하여 절제함으로써 이루어집니다. 다음으로, 겐타마이신(Gentamycin)을 씻어내고 물고기는 담수에서 여러 번 신경 돛대를 재생하도록 합니다.

그런 다음 물고기를 바이탈 염료로 염색하여 지정된 시점에서 측선 회복을 시각화합니다. 이 약물이 신경 비만을 제거하는 데 효과적이라는 것을 확인하기 위해, 일부 물고기는 겐타마이신(Gentamycin)을 씻어낸 직후에 염색해야 합니다. 그런 다음 물고기 또는 피부 제제의 측선의 신경 마스트는 형광 또는 컨포칼 현미경으로 얻은 이미지를 사용하여 계산됩니다.

마지막으로, 실험 그룹은 재생 신경 마스트 표준 곡선을 사용하여 대조군과 정량적으로 비교됩니다. 궁극적으로, 형광 및 컨포칼 현미경 검사는 성체 제브라피시 질병 모델에서 측선의 재생을 모니터링하는 데 사용됩니다. 우리는 성인 제브라피시 질병 모델에서 신경 재생 검사를 위한 정량적 분석을 제공하기 위해 이 기술을 개발했습니다.유모 세포 괴사를 유도하기 위해 물고기 물에 있는 황산 겐타마이신 1밀리리터당 50밀리그램의 용액을 최종 농도 0.004%에 첨가하는 것으로 시작합니다.통기 없이 4-6개월 된 제브라 피쉬를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 용기를 사용하여, Gentamycin 해결책으로 그것을 채우십시오.

물고기를 안에 넣고 섭씨 28도에서 24시간 동안 부화시킵니다. 겐타마이신을 씻어내기 위해 일반 생선 물의 어항을 준비하십시오. 겐타마이신을 씻어낸 후 물고기를 일반 생선 물에 넣고 형광 생명 염료의 밀리리터당 15밀리그램 작업 원료 용액에서 8-16시간 동안 섭씨 28도의 인큐베이터에 다시 넣습니다.

4 개의 4 개의 다틸 아미노 스티로와 메틸 페리듐 요오드화물 또는 4 개의 염료 2 A. 물고기 물에 0.08 % 농도를 준비하십시오 겐타마이신 처리로 지정된 회수 시간 후, 각 물고기를 생명 염료가 들어있는 6 개의 우물 배양 플레이트의 우물에 넣으십시오. 플레이트를 덮고 얼룩진 신경 마스트를 검사하기 위해 형광 현미경 옆의 벤치 서랍에 넣습니다. 활성 염료의 담금질을 방지하기 위해 조명을 끄고 겐타마이신의 세척 후 선택한 시간에 1 시간 동안 배양하십시오.

각 물고기를 마취수에 넣어 마취하고 약 1-2분 동안 수영 동작이 멈출 때까지 기다립니다. 다음으로, 종이 타월로 각 생선을 닦아내고 플라스틱 페트리 접시 뚜껑 중앙에 있는 축축한 여과지 조각에 놓습니다. 그런 다음 형광 실체 현미경의 스테이지에 뚜껑을 놓고 두 개의 배율을 사용하여 정량 분석을 위해 이미지를 캡처합니다.재생량을 결정하려면 오른쪽 가슴 지느러미에 바로 근접한 물고기의 가장 아래쪽 복부 쪽에 있는 4개의 지정된 바늘 내에서 보이는 신경 마스크의 수를 계산합니다.

통계 분석을 위해 학생의 T-검정 또는 분산 분석을 사용하고 실험당 최소 5마리의 물고기로 모든 실험을 3회 반복합니다. 신경 마스트 수준에서의 정량적 분석이 중요하지 않은 경우, 개별 유모 세포 수준에서의 분석도 더 높은 수준의 해상도를 얻기 위해 활용할 수 있습니다. 생선을 염색하고 씻어낸 후 두 개의 페녹시에탄올을 1:500 희석하여 차분한 빛 아래에서 안락사시킵니다.

배를 절개하고 처음 두 절개 부위의 양쪽에 두 개의 수직 절개를 만듭니다. 그런 다음 항문 지느러미와 정렬될 때까지 물고기의 위쪽 갈비뼈를 따라 절개하여 사각형 피부 플랩을 만듭니다. 피부 표본을 유리 슬라이드에 놓고 그 위에 아로스를 놓은 다음 그 위에 원형 유리 덮개 슬립을 놓아 조직을 고정하고 평평하게 만듭니다.

후속 디지털 이미징용. 60 x 대물렌즈를 사용하여 중간 실밥의 각 신경 마스트 내에 있는 유모 세포의 디지털 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 대조군과 실험군의 비교 및 정량적 분석을 위해 개별 신경 마스크 내의 유모 세포를 계산합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 제브라 피쉬 머리는 이 패널에서 볼 수 있듯이 중간 부분이나 꼬리에 비해 훨씬 더 많은 수의 신경 돛대를 가지고 있으며, 꼬리 부위는 신경 마스크의 수가 가장 적습니다. 머리의 꿰맨 패턴은 복잡하고 신경 마스크의 수가 훨씬 더 많기 때문에 정량적 분석을 위한 영역으로 적합하지 않았습니다. 또한, 테스트된 겐타마이신 농도에 관계없이 머리 전체의 신경 마스크의 완전한 절제는 거의 불가능했으며, 이전에 보고된 바와 같이 겐타마이신 치료 후 신경 마스크의 반점이 관찰되었습니다.

대조적으로, 꼬리에는 두 개의 몇 개의 신경 마스크가 있으며, 이에 따라 신경 비만 재생을 정량적으로 분석하기 위해 중간 신체 영역을 선택했습니다. 이 부위의 성인에서, 우리는 모든 성인의 신경 마스트 수가 일치하는 외측 가슴 지느러미 바로 뒤쪽에 4개의 바늘을 확인했다. 중요하게, 우리는 일관되고 완전하게 이전에 보고된 것과 같이 신경 돛대 재생의 연속적인 정확한 결심을 허용하는 것과 같이 24 시간 0.004%Gentamycin 처리에 의해 이 지구의 신경 돛대를 abulate 할 수 있었다, 재생은 4개의 중간 몸 스티치 내의 모든 신경 가면이 24 시간 Gentamycin 처리 후에 절제된 후에 감시되고 긍정적인 재생은 a내의 3개의 신경 돛대의 최소한의 외관에 의해 결정되었다 이전에 보고된 것과 같이 겐타마이신 포스트 8 시간까지 스티치.

물고기의 약 1/3이 회복의 징후를 보였습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 신경종의 강도는 재생 바늘땀에서 희미했습니다. 신경 돛대의 수와 그 강도는 겐타마이신 후 16시간에 재생이 고원에 도달할 때까지 선형 방식으로 계속 증가했습니다.

신경종 분석에서 얻은 결과가 대조군과 실험군 간에 통계적으로 유의하지 않은 경우, 이러한 연구를 개별 유모 세포 수준까지 확장하여 8시간, 10시간 및 12시간의 재생 시간에서 정량적 비교를 위한 더 높은 수준의 해상도를 얻을 수 있습니다. 우리는 대조군이 정량적으로 분석했을 때 대조군에 대해 예상했던 것처럼 중간 신체 영역의 신경 비만당 0에서 4개의 유모 세포 범위를 가지고 있음을 발견했습니다. 이 시점에서 신경종(neuromas) 간의 통계적 차이는 신경비만당 유모 세포의 관점에서 발견되지 않았습니다.

이 절차를 시도하는 동안 항상 시간을 의식하는 것이 중요합니다. 물고기를 게나미신에 24시간 이상 방치하거나 발병 후 75분 이상 바이탈 염료를 방치하지 마십시오. 이 기술은 재생 의학 분야의 연구자들이 정상 상태 및 제브라피시 모델과 비교하여 질병 상태에서의 측선 재생을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.