마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화
May 19th, 2014
우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 발달 중인 배아 표피를 통해 측면으로 이동할 때 Melano blasts 개체군의 행동을 이해하는 것입니다. 이는 E 14.5 마우스 배아의 피부를 절개하여 체외 유기형 배양을 가능하게 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 절개된 피부는 맞춤형 배양 장치에 장착되어 액체 계면에서 배양할 수 있습니다.
다음으로, 챔버를 컨포칼 현미경의 스테이지에 장착하여 이동하는 멜라노 아세포 집단을 이미지화합니다. 18시간 동안 6개의 배아 피부 배양을 병렬로 이미징하면 멜 오블라스트(Mel Oblasts)의 이동과 1차 모낭의 발달을 보여줍니다. 발작 혼성화(seizure hybridization)에서 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 락타아제(lactase) 염색과 같은 멜 오블라스트(Mel Oblasts)를 시각화하는 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 실시간 이미징을 수행할 수 있으므로 개별 세포를 보고 시간 경과에 따른 이동 및 증식을 분석할 수 있다는 것입니다.
이 방법은 색소 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 멜론 블라스트 행동이 색소 돌연변이에서 어떻게 방해를 받는지, 멜라노 블라스가 발달 중인 모낭으로 어떻게 국한되는지, 배아 일차에 이 절차를 위해 14.5 차가운 PBS 수확 배아에서 멜라노 블라스트를 발현하는 배아, 특정 Cree 재조합효소 및 필요한 경우 형광 Cree activat 리포터 구축, 형광 리포터의 발현을 위해 배아를 스크리닝합니다 필요한 배아를 선택한 후 목을 베고 면도날로 팔다리를 제거합니다. 배아 피부를 채취하기 위해 필요한 경우 유전형 분석을 위해 이러한 조직을 보관하십시오. 먼저 정중선에 가까운 독을 Ros coddle 절개합니다.
다음 단계에서는 Kashiwa와 회사에서 설명한 도구가 필요합니다. 면도날을 사용하여 15cm 길이의 대나무 꼬치의 평평한 끝에 작은 슬릿을 만든 다음 슬릿에 부드러운 칫솔 강모를 삽입합니다. 이 헤어 스틱 도구를 사용하여 배아를 회전시키면서 아래에 있는 결합 조직의 피부를 조심스럽게 떼어냅니다.
첫 번째 절개 부위의 복부 가장자리를 따라 피부는 부착된 상태로 두되 피부를 장착할 다른 곳은 없습니다. 몇 가지 준비가 필요합니다. 클립, 인서트 및 O-링을 하룻밤 동안 70% 에탄올 수조에서 살균하십시오.
먼저 섭씨 60도로 예온된 배양 배지와 섭씨 60도의 용융물, 2%aros를 동일한 부피로 혼합하여 클립을 준비합니다. 그런 다음 결과 생성된 1%Aros 용액으로 이미징 클립을 적극적으로 채우고 냉각하고 응고시킵니다. 일단 굳으면 각 웰에 PBS 1밀리리터를 추가하여 클립이 마르는 것을 방지합니다.
클립은 사용하기 전에 몇 시간 동안 사용할 수 있습니다. 이제 명반의 접시에서 명반의 멤브레인을 절단하고 O-링을 사용하여 각 멸균 인서트에 멤브레인을 고정하여 인서트를 준비합니다. 클립 인서트 어셈블리가 들어 있는 바닥은 70% 에탄올로 닦아서 청소합니다.
그런 다음 6개의 인서트가 베이스에 배치됩니다. 6웰 플레이트의 멸균 뚜껑을 사용하여 베이스의 인서트를 둘러쌉니다. 이제, 첫 번째 배아의 껍질을 거의 벗겨낸 후, 그것을 마른 페트리 접시에 옮겨 담는다.
헤어 스틱을 사용하여 주름 없이 접시 피부가 위로 향하게 하여 피부를 평평하게 만듭니다. 그런 다음 면도기로 피부를 잘라냅니다. 약 반 평방 센티미터 여야합니다.
PBS에서 이미징 클립을 가져와서 에어로스의 표면을 건조시키고 피부에 올려 에어로스가 조직의 진피 쪽에 닿도록 합니다. 진피가 아로스에 부착되는 동안 60초 동안 기다린 다음 조직의 가장자리를 클립의 측면으로 조심스럽게 놀립니다. 헤어 스틱을 사용합니다.
클립을 뒤집어 이미지화할 영역을 최소한으로 건드리지 않고 거품을 제거하고 아로스의 피부를 평평하게 만듭니다. 헤어 스틱을 사용하여 실크 봉합사로 클립의 양쪽에 피부를 고정하고 조일 때 몇 가지 간단한 엄지 매듭을 지으면 실이 피부를 클립 상단의 홈으로 당겨야 합니다. 이제 클립을 이전에 베이스에 장착된 이미징 인서트에 밀어 넣습니다.
그런 다음 삽입물에 약 5ml의 배양물, 배지를 채우고 이미징을 진행합니다. 이 절차는 나머지 인서트 및 클립 어셈블리 각각에 대해 추가로 5개의 배아를 사용하여 반복됩니다. 컨포칼 현미경은 공기 중 이산화탄소의 5%를 제공하는 환경 챔버 또는 스테이지 상단 챔버와 자동화된 스테이지가 필요합니다.
사용하기 전에 환경 챔버를 섭씨 37도로 최소 1시간 동안 예열하십시오. 제어 소프트웨어를 사용하여 이미징 실험을 신속하게 실행할 수 있는 다중 위치 템플릿을 준비합니다. 이미지화할 6개의 위치를 정의합니다.
일반적으로 18시간에서 24시간 동안 2분마다 각 위치에서 작은 Zack을 수집합니다. Zacks는 최적의 핀홀 설정보다 넓은 이미지를 선택하고 3-5개의 작은 이미지를 촬영하여 장시간의 이미징 기간 동안 레이저가 조직을 손상시키는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 스테이지에 장착할 때 적절한 플레이트 인서트를 사용한 다음 이미징 프로그램을 진행하십시오.
배아 피부 배양을 준비하고 타임랩스 이미지를 만들었습니다. YFP 채널을 보는 프로토콜에 따르면, 멜 오블라스트는 거의 끊임없이 움직였으며 투과광 아래에서 유사분열을 겪기 위해 멈췄을 뿐입니다. 발달하는 피부와 일차 모낭 패턴의 형성이 복합 서열에서 관찰되었습니다.
멜라노 블라스트, 유사분열 및 모낭 발달은 WR MAC 플러그인을 사용하여 함께 식별할 수 있습니다. 이미지 J의 경우, 캡처된 6개의 타임 랩스 시퀀스 각각에서 이동하는 멜라노 블라스트 개체군을 추적할 수 있었습니다. 동시에 Melano 폭발의 표현.
추적 결과는 발달 중인 피부 배양 내의 움직임 정도를 보여줍니다. 추적에 0을 사용하는 추적 데이터 요약은 Mel Oblasts 이동의 무작위 특성을 강조하고 어떻게 퍼져 나갔는지 보여줍니다. 해부와 배양 설정을 마스터하면 작업자는 약 90분 안에 완료할 수 있습니다.
이 기술은 발달 생물학 및 암 분야의 연구자들이 여러 돌연변이 마우스 배경에서 배아 발달 중 멜라노 아세포 행동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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개요
이 연구는 멜라논세포의 행동을 관찰하기 위해 마우스 배아 피부의 해부 및 체외 배양에 초점을 맞추고 있습니다. 배양 시스템은 공기-액체 인터페이스를 유지하여 공초점 현미경을 사용한 세포 이동의 생체 이미징을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발달 생물학
- 세포 생물학
배경
- 멜라논세포는 피부 발달에 중요합니다.
- 그들의 이동을 이해하는 것은 발달 생물학에서 중요합니다.
- 면역조직화학 같은 전통적 방법에는 한계가 있습니다.
- 생체 이미징 기술은 실시간 인사이트를 제공합니다.
연구 목적
- 배아 피부에서 멜라논세포의 이동을 관찰합니다.
- 향상된 이미징을 위해 체외 배양을 활용합니다.
- 생체 이미징과 전통적 방법을 비교합니다.
사용된 방법
- E 14.5 마우스 배아에서 피부 해부.
- 공기-액체 인터페이스에서의 체외 장기 유형 배양.
- 세포 행동 이미징을 위한 공초점 현미경.
- 18시간 기간 동안 여러 배양의 평행 이미징.
주요 결과
- 표피에서 멜라논세포의 이동을 입증했습니다.
- 1차 모낭의 발달을 관찰했습니다.
- 시간에 따른 개별 세포 행동에 대한 인사이트를 제공했습니다.
- 생체 이미징이 기존 기술보다 우수함을 보여주었습니다.
결론
- 생체 이미징은 멜라논세포 행동을 연구하는 데 효과적입니다.
- 배양 시스템은 피부 발달의 상세한 관찰을 가능하게 합니다.
- 이 방법은 피부 생물학에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-resolution ex vivo imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin enables direct observation of cell behavior in a physiologically relevant context. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for pigment cell biology and developmental pathways. The method's parallel imaging throughput enhances predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cell migration and proliferation dynamics in intact tissue.
- Supports functional validation of genetic targets affecting pigment cell development.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing cell behavior in normal and mutant backgrounds.
- Improves predictive confidence for pathway interrogation and target triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic skin cultures for quantitative live-cell imaging assays.
- Enables reproducible, parallel imaging of multiple samples for comparative analysis.
- Supports assay standardization and scalability for screening pigment cell modulators.
- Provides quantitative outputs for migration and proliferation metrics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for studying pigmentation disorders and developmental defects.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation in genetically engineered models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking cell behavior to genetic perturbations.
- Offers predictive de-risking for translational biomarker identification.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo imaging method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analysis of cell migration in a native tissue context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of pigment cell migration and localization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides time-lapse tracking data and cell movement metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for pigment cell and developmental biology studies across multiple genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pigment cell research.
- Operational Value: Standardizes live-imaging workflows and enables parallel sample processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue dissection and live-cell imaging.
- Needs access to confocal microscopy with environmental control and automated stage.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various genetic backgrounds and pigment cell models.
- Dependent on maintaining tissue viability and imaging quality over extended time-lapse periods.
