분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의 시험관 심장 비대

[내레이터] 이 절차의 전반적인 목표는 기능성 성인 마우스 심근 세포의 배양을 위한 일관된 준비를 산출하는 것입니다. 먼저 마취 및 캐뉼라 삽입 하에 마우스 심장을 제거합니다. 심장을 관류하고 콜라게나제로 소화합니다. 그런 다음 세포를 해리하고 칼슘을 다시 도입합니다. 다음으로 세포를 파종하고 일차 심근 세포를 배양합니다. 웨스턴 블롯 및 삼중소화 류신 혼입 분석의 결과는 PI3 키나아제 의존성 AKT 인산화의 활성화 및 Ouabain에 의해 유도된 단백질 합성 속도의 증가와 같은 기능을 입증할 수 있습니다.

- 심장을 격리한 후 다른 많은 혈관에서 대동맥을 빠르게 부채꼴로 만든 다음 대동맥을 매우 조심스럽게 다루고 첫 번째 시도에서 빠르게 연결합니다. 연습을 통해 색상과 부드러움 변화를 정확하게 모니터링하여 심장의 콜라게나제 소화를 중단할 시기를 결정할 수 있습니다.

- 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 박사후 연구원인 Daxiang Li 박사가 될 것입니다.

- [내레이터] 관류 직전에 II형 콜라게나제를 함유한 신선한 소화 완충액을 준비하고 분리할 준비가 되면 완충액을 섭씨 37도로 데운다. 가위와 집게를 70% 에탄올에 담그고 건조시킵니다. 이제 마우스의 무게를 10분의 1그램으로 가깝게 측정합니다. 체중, 변형률, 성별 및 생년월일을 기록합니다. 관상 동맥의 혈액 응고를 방지하기 위해 200마이크로리터의 헤파린을 복강 주사합니다. 10분 후, 마우스를 마취한다. 5-10분 후 마우스가 꼬리나 발가락을 끼워도 반응하지 않는지 확인한 다음 앞발과 뒷발을 작업 표면에 부드럽게 고정하여 마우스를 바로 누운 자세로 고정합니다. 70% 에탄올로 가슴과 복부를 닦은 후 복부 중앙에서 횡격막까지 정중선 피부 절개를 합니다. 흉골을 잡고 양측으로 절단합니다. 다음으로 횡격막을 자르고 흉곽을 역편향시켜 심장을 노출시킵니다. 이제 심장을 약간 들어 올리고 흉강에서 가능한 한 등쪽 흉벽에 가깝게 심장을 해부합니다. 심장을 100mm 접시의 차가운 풍부 완충액으로 옮깁니다. 폐, 흉선, 기관지 및 식도와 같은 결합 조직을 조심스럽게 잘라냅니다. 이제 대동맥과 흉선과 지방 패드에 숨겨져 있는 두개골 가지를 식별하십시오. 첫 번째 가지 아래의 대동맥을 자르고 대동맥벽을 잡고 심장을 들어 올립니다. 풍부한 액체가 떨어지고 있는지 확인한 다음 캐뉼라 끝을 대동맥 판막 바로 위에 유지하면서 관류액으로 채워진 대동맥 캐뉼라에 심장을 살짝 밀어 넣습니다. 대동맥을 캐뉼라에 고정하고 6-0 수술용 실크로 대동맥을 캐뉼라에 결찰합니다. 유출물이 맑아질 때까지 약 4-5분 동안 분당 4밀리리터의 유속으로 칼슘이 없는 다류 완충액으로 심장을 관류한 다음 50마이크로몰 염화칼슘을 함유한 소화 완충액으로 전환합니다. 해당되는 경우 소화 시 부하 후 압력을 70-80mm의 수은으로 높이십시오. 심장이 약간 창백해지고 이완되면 살짝 꼬집었을 때 해면질인지 확인한 후 소화를 멈춥니다. 70% 에탄올에 적신 겸자를 사용하여 캐뉼라에서 대동맥을 당겨 2.5밀리리터의 소화 완충액이 들어 있는 멸균 60밀리미터 접시에 심장을 넣습니다. 이제 세포 배양 후드로 이동하여 멸균 용품과 멸균 기술을 사용하십시오. 가는 수술용 가위로 대동맥, 심방 및 대혈관을 제거합니다. 그런 다음 심실을 10-12개의 작은 조각으로 부드럽게 놀립니다. 10밀리리터 이송 피펫을 사용하여 심장 조각과 세포를 부드럽게 피펫팅하고 샘플을 15밀리리터 폴리프로필렌 원추형 튜브로 옮깁니다. 7.5밀리리터의 칼슘 용액 I로 접시를 헹구고 세척액을 원추형 튜브로 옮기면 최종 부피가 10밀리리터가 됩니다. 다음으로, 가는 팁 이송 피펫으로 부드럽게 피펫팅하여 심장 조직의 큰 조각을 분산시킵니다. 그런 다음 20G에서 3분 동안 원심분리하여 내피 세포 및 섬유아세포와 같은 작은 비근세포 세포를 분리합니다. 상청액을 흡인합니다. 근세포 펠릿을 ATP를 보충한 칼슘 용액 10밀리리터에 재현탁하고 3-5분 동안 평형을 유지합니다. 다음으로 복제된 10마이크로리터 분취량을 혈구계로 옮깁니다. 막대 모양의 근세포와 둥근 근세포를 세고 총 근세포 수를 계산하고 막대 모양의 근세포의 비율을 결정합니다. 원심분리에 의해 근세포를 펠릿화합니다. 상청액을 제거하고 칼슘 농도가 증가하는 10밀리리터로 펠릿을 연속적으로 세척합니다. 마우스 근세포 1차 배양의 경우, 칼슘 내성 심근 세포를 얻기 위해 최종 근세포 펠릿을 5밀리리터의 도금 배지에 재현탁합니다. 총 근세포 수를 계산하고 막대 모양의 감막세포의 백분율을 계산합니다. 막대 모양의 근세포의 농도를 밀리리터당 25,000개의 막대 모양의 근세포로 조정합니다. 근세포를 부드럽게 피펫팅하여 각 접시 또는 플레이트의 세포 밀도가 동일하도록 합니다. 배양 플레이트에서 라미넨 코팅 용액을 흡인한 후 심근 세포를 파종하고 배양 후드 표면에 십자형 패턴으로 접시를 앞뒤로 좌우로 부드럽게 밀어 세포를 고르게 분산시킵니다. 배양물을 섭씨 37도의 2% 이산화탄소 인큐베이터에 넣어 약 80%의 속도로 근세포가 부착될 수 있도록 합니다. 이제 부착되지 않은 근세포와 세포 파편이 포함된 배지를 부드럽게 흡인합니다. 한 번에 한 접시씩 접시의 측면을 겨냥하여 배양 배지를 보충하십시오. 즉시 세포를 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 성공적인 준비에서 분리된 근세포는 일반적으로 직사각형 끝과 명확한 십자 줄무늬가 있는 뚜렷한 로드 모양을 갖습니다. 기능적 분석으로서, 성체 C57 흑색 6개 마우스 심근세포를 배양하고 Ouabain 및 ET1로 처리하였다. 이러한 데이터는 Ouabain 및 ET1이 용량 의존적 방식으로 AKT 인산화를 증가시킬 수 있고 단백질 합성 중에 삼중수화 류신 혼입을 유도할 수 있음을 보여줍니다. 이 기술은 심장병 분야의 연구자들이 유전자 변형 마우스의 심장 조절 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.