마우스 후뇌 전의 VIVO 문화 얼굴 Branchiomotor 신경 세포의 마이 그 레이션을 연구하는

이 절차의 전반적인 목표는 배아 마우스 뒷뇌의 생체 외를 배양하여 안면 상완 신경 운동 뉴런의 이동을 조절할 수 있는 후보 분자를 연구하는 것입니다. 이것은 오픈 북 준비에서 배양을 위해 배아의 첫 번째 마이크로 해부 11.5 마우스 뒷뇌를 통해 이루어집니다. 두 번째 단계는 관심 분자로 코팅된 헤파린 비드를 뒷뇌에 이식하거나 약리학적 화합물이 함유된 배지를 준비하는 것입니다.

다음으로, 절개된 뒷뇌를 배양 삽입물에 조심스럽게 놓습니다. 마지막 단계는 섭씨 37도에서 24시간 동안 외식을 배양하여 뉴런이 궁극적으로 뒷뇌 산 전체에서 면역 형광 현미경으로 이동할 수 있도록 하는 것입니다. 외식은 후보 분자가 안면 상완 운동 뉴런 이동에 미치는 영향을 밝히는 데 사용됩니다.

이 방법은 발달 중인 기관지 운동 뉴런의 이동을 안내하는 매력 및 반발 신호를 이해하고 심는 날에 새로운 안내 분자를 식별하는 것과 같은 신경 세포 이동 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저, 멸균 PBS에서 삽입물을 5분 동안 세척한 다음 5-10분 동안 시도하여 플로우 후드에 배양 삽입물을 준비합니다. 그런 다음 12웰 플레이트의 각 웰에 하나의 배양 삽입물을 놓고 필요에 따라 아래로 눌러 웰에 단단히 맞도록 합니다.

신경 기저 배지에서 밀리리터당 10-20마이크로그램의 마우스 라미닌으로 배양 삽입물을 덮고 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 한 시간 동안. 임신한 암컷 쥐를 안락사시킨 후, 배아 Day 11.5 배아가 들어 있는 자궁을 100mm 플라스틱 접시에 넣고 얼음처럼 차가운 L 15 배지를 해부 현미경으로 넣습니다.

집게를 사용하여 자궁 근육 벽을 찢고 배아를 노출시킵니다. 각 배아를 방출한 후 탯줄을 절단하고 구멍이 넓은 플라스틱 피펫을 사용하여 노른자 자루를 조심스럽게 제거한 후 각 배아를 얼음처럼 차가운 L 15와 함께 깨끗한 플라스틱 접시에 옮깁니다. 실험에서 배아의 유전형 분석이 필요한 경우 게놈 DNA 분리를 위해 작은 꼬리 조직 조각을 수집합니다.

다음으로, 집게를 사용하여 네 팔다리 바로 위에 있는 배아의 목을 베십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 머리의 등쪽을 위로 돌리고 얇은 조직층으로 덮인 네 번째 뇌실을 식별합니다. 집게로 지붕 플레이트를 조심스럽게 뚫고 벗겨내기 시작합니다.

조잡하게는 후방 뒷뇌와 척수 위의 정중선을 따라, 그리고 중뇌 위를 롤리합니다. 이제 뒷뇌가 노출되어야 합니다. 뒷뇌의 껍질 쪽에 붙어 있는 나머지 머리 중간엽과 수막을 조심스럽게 떼어냅니다.

중뇌와 척수 조직을 제거하여 뒷뇌가 펼쳐지고 평평하게 놓이도록 합니다. 광역 플라스틱 파스터 피펫을 사용하여 펼친 책 준비에서 절개된 뒷뇌를 얼음처럼 차가운 L 15가 들어 있는 12웰 플레이트로 옮기고 모든 뒷뇌가 해부될 때까지 얼음 위에 보관합니다. 모든 뒷뇌를 해부한 후 넓은 구멍의 플라스틱 목초지 피펫을 사용하여 단일 뒷뇌를 빈 접시에 옮깁니다.

뒷다리 뇌를 열린 책 준비 심실 쪽이 위로 향하게 유지합니다. 약 100마이크로리터의 L 15 방울을 추가합니다. 이전에 준비된 헤파린 비드가 들어 있는 현탁액을 회수하고, 비드 현탁액 몇 마이크로리터를 뒷뇌가 들어 있는 액적으로 옮깁니다.

현탁액은 약 10 내지 100개의 비드를 함유할 수 있습니다. 이제 뒷뇌의 정중선과 측면 가장자리 사이의 중간 쯤에 있는 R 5 6 경계 수준에서 뒷뇌 조직을 약간 찢습니다. 이제 약 200미크론으로 추정되는 직경을 가진 1-3개의 구슬을 조직 안으로 내려 조심스럽게 삽입합니다.

각 구슬은 뒷뇌 표면 바로 아래에 위치하여 후속 배양 중에 떠다니지 않도록 해야 합니다. 나머지 뒷뇌 중 두 개를 제외한 모든 뇌에 구슬을 계속 삽입하면 정상적인 성장 조건에서 배양되어 대조군 역할을 합니다. 해부 중에 신속하게 작업하여 늦어도 사후 3시간 이내에 뒷뇌 배양을 시작합니다.

뒷뇌 X 엑스플랜 배양을 준비합니다. 먼저 인큐베이터에서 배양 삽입물이 들어있는 플레이트를 제거하고 라미닌 코팅 용액을 흡입합니다. 얼음처럼 차가운 L 15를 채운 별도의 배양 접시에 하나의 배양 삽입물을 넣고 넓은 멧돼지 플라스틱 목초지 피펫을 사용하여 각 뒷뇌 복부 쪽을 위로 향하게 하여 배양 삽입물로 옮깁니다.

뒷뇌는 삽입막에 완전히 평평하게 놓여야 합니다. 접시에서 배양 삽입물을 조심스럽게 들어 올리고 깨끗한 티슈 페이퍼에 여러 번 두드려 여분의 액체를 제거합니다. 이 과정은 뒷뇌가 배양을 고수하도록 합니다.

편평하게 펴서 준비 서에 삽입하고 뒷뇌가 평평하게 유지되는지 확인합니다. 말리면 피펫으로 부드럽게 조작하여 평평하게 만드십시오. 원래 500웰 플레이트의 각 웰에 전쟁 전 이식 배양 배지 500마이크로리터를 추가한 다음 뒷뇌가 포함된 삽입물을 다시 그 구멍에 넣습니다.

다른 400-600 마이크로리터의 xplan 배양 배지로 부피를 조심스럽게 조정하여 뒷뇌가 막에서 떠오르지 않도록 합니다. 이 단계에서 관심 있는 생물학적 억제제를 추가하여 신경 세포 이동에 미치는 영향을 연구합니다. 이제 조직 배양 인큐베이터에서 24-30시간 동안 외식을 배양합니다.

배양 후 각 우물에서 배지를 흡입한 다음 PBS에서 뒷뇌를 헹구고 갓 준비한 얼음처럼 차갑게 고정합니다. 4%포름알데히드를 섭씨 4도에서 2시간 동안 고정 후 부드러운 교반으로 사용합니다. PBS로 각 뒷뇌를 세 번 헹굽니다.

이제 해부 현미경 아래에서 집게를 사용하여 배양 삽입물에서 뒷뇌를 조심스럽게 벗겨냅니다. 엑스플랜을 벗겨내기 어려운 경우, 파이펫에서 PBS를 반복적으로 배출하여 부드러운 압력을 가하십시오. 면역형광 라벨링을 위해 뒷뇌를 2.0ml 원형 바닥 튜브로 옮깁니다.

라벨링 및 고정 후 유리 슬라이드를 3 층의 검은 색 전기 테이프로 덮고 메스를 사용하여 겹쳐진 테이프의 작은 사각형을 제거하여 x explants를위한 주머니를 만듭니다. 다음으로, 넓은 구멍의 과거 피펫을 사용하여 각 뒷뇌를 하나의 주머니로 옮기고 피펫으로 과도한 PBS를 제거합니다. 다음으로, 각 뒷뇌를 느린 페이드 시약으로 덮은 다음 조심스럽게 유리 커버 슬립을 미끄러뜨립니다.

기포가 갇히지 않도록 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 면역이 표지된 뒷뇌를 이미지화합니다. 11.5일째부터 이식된 뒷뇌의 안면 완류 신경 운동 뉴런, 마우스 배아는 뒷뇌의 양쪽에 있는 흐름으로 접선 이동을 겪습니다. 이 심실 보기에서 볼 수 있듯이, 그들은 이 peel view에서 볼 수 있듯이 안면 운동 핵으로 조립하기 시작합니다.

자궁 내에서의 행동과 유사하게, 정중선은 각 패널에 별표로 표시됩니다. 배아 11.5일째, 새끼 짝 뒷뇌는 PBS에 담그거나 V EEG F1 65로 코팅된 이식된 헤파린 구슬의 존재 하에서 배양되었습니다. V EEG F1 65 비드를 포함하는 후뇌 쪽의 안면 완완 신경 운동 뉴런은 비드와 이동 흐름을 향하여 이동했기 때문에 동일한 뒷뇌 또는 대조 비드를 포함하는 뒷뇌의 치료되지 않은 쪽에 비해 더 꼬치구불하게 확장되었습니다. 표시.

다음은 안면 상완 운동 뉴런이 R 4에서 이동하지 않았거나 배양 중에 뒷뇌 조직이 접힌 불만족스러운 E 11.5 뒷뇌 이식의 예입니다. 이 절차를 시도하는 동안 뒷뇌 조직이 손상되지 않도록 조심스럽게 절개하고 조직의 뉴런이 생존할 수 있도록 신속하게 이식 배양을 설정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.