Name: β-catenin의 저하의 재구성 Xenopus의 계란 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 배우세요 Xenopus 계란 추출물을 이용한 β-catenin 단백질 분해 분석 방법입니다. 이 기술은 세포 신호 전달 연구에서 단백질 조절 메커니즘을 효율적으로 규명하는 데 활용됩니다.

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우리는 원고의 중요한 읽기 로리 리 감사합니다. TWC는 미국 심장 협회 (American Heart Association) Predoctoral 원정대 (12PRE6590007)에 의해 지원된다. MRB는 국립 암 연구소 교육 교부금 (T32의 CA119925)에 의해 지원된다. SSH는 건강의 국립 연구소 (R01DK078640)에 의해 지원된다. EL는 건강의 국립 연구소 (R01GM081635 및 R01GM103926)에 의해 지원된다.

<ol><li>Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+is+degraded+by+the+ubiquitin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway.</a> Nature. 349, 132-138 (1991).</li>
<li>Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+beta-catenin+stability%3A+reconstitution+of+the+cytoplasmic+steps+of+the+wnt+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Dabauvalle, M. C., Scheer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nuclear+pore+complexes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract.</a> Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+profilin+in+the+actin-based+motility+of+L.+monocytogenes+in+cells+and+in+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts.</a> Cell. 76, 505-517 (1994).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Shennan, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+extracts%3A+a+model+system+to+study+proprotein+convertases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases.</a> Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).</li>
<li>Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cell+cycle+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts.</a> Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Masui, Y., Markert, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+control+of+nuclear+behavior+during+meiotic+maturation+of+frog+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+zoology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes.</a> The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>Newport, J. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+cell+cycle+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the cell cycle during early Xenopus development.</a> Cell. 37, 731-742 (1984).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47, 577-587 (1986).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubistatins+inhibit+proteasome-dependent+degradation+by+binding+the+ubiquitin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain.</a> Science. 306, 117-120 (2004).</li>
<li>Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+ubiquitin-conjugating+enzyme+involved+in+mitotic+cyclin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation.</a> Curr Biol. 6, 455-466 (1996).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+Wnt+signaling+through+activation+of+casein+kinase+1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha.</a> Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li>
<li>Hinkson, I. V., Elias, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+state+of+protein+turnover%3A+It%27s+about+time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic state of protein turnover: It's about time.</a> Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).</li>
<li>Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Hereditary+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lessons from Hereditary Colorectal Cancer.</a> Cell. 87, 159-170 (1996).</li>
<li>Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+regulation+of+%5Bbeta%5D-catenin+stability+by+Tcf3+and+CK1epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon.</a> J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).</li>
<li>Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li>
<li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li>
<li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li>
<li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3%27s+phosphorylation+of+%CE%B2-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li>
<li>Jernigan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gbetagamma+activates+GSK3+to+promote+LRP6-mediated+beta-catenin+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity.</a> Science Signaling. 3, (2010).</li>
<li>Major, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilms+tumor+suppressor+WTX+negatively+regulates+WNT%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling.</a> Science. 316, 1043-1046 (2007).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+Laevis+%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Rubinfeld, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+GSK3%CE%B2+to+the+APC-%CE%B2-Catenin+Complex+and+Regulation+of+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly.</a> Science. 272, 1023-1026 (1996).</li>
<li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
<li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Xenopus의 계란 추출물은 β-catenin의 회전율을 조사하기위한 강력한 생화학 적 시스템입니다. Xenopus의 계란 추출물의 β-catenin의 농도는 ~ 25 nm의 2입니다. 최적의 조건 하에서, 계란 추출물은 50 ~ 100 ㎚ / hr의 속도로 β-카테닌을 저하 할 수 있고 200에서 24 nM의 최대량의 절반이다. Xenopus의 계란 추출물을 사용하여 β-catenin의 분해를 성공적으로 재구성에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이러한 고품질 Xenopus의 계란 추출물과 계란 추출물이 준비하는 방법을 생성 1)을 포함, 2) 품질의 방사성 동위 원소의 β-catenin의 및 β-catenin이 - 루시 페라 제 단백질, 3) β-catenin의 분해를 지원하기위한 반응 조건의 최적화, 4를 생성 반응 시간 포인트) 적절한 처리. β-catenin...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

는 Xenopus laevis의 계란 추출물은 세포 골격 역학, 핵 조립 및 수입, 세포 사멸, 유비퀴틴 대사, 세포주기의 진행, 신호 전달, 단백질 회전율 1-17를 포함하여 많은 세포 생물 학적 과정을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 계란 추출물은 본질적으로 이러한 프로세스를 실행하고 조사를 활성화하는 데 필요한 모든 필수 세포질 구성 요소가 포함되어 희석 세포질을 나타 내기 때문에 Xenopus의 계란 추출물 시스템은 세포 프로세스의 군단의 생화학 적 분석에 대한 의무입니다. 계란 추출물 많은 양의 물질 ​​(예, 단백질 정제 또는 고 처리량 스크리닝) 18-20의 많은 양을 필요로 생화학 적 조작에 대해 한 번에 제조 할 수있다. 또 다른 장점은 Xenopus의 계란 추출물에서 특정 단백질의 농도가 정확하게 재조합 단백질 및 / 또는 endog immunodepletion의 첨가에 의해 조절 될 수 있다는 것이다또한 단백질의 발현을 제어하기 어렵다 플라스미드 DNA의 형질 대조적 enous 단백질. 또, 사용 가능한 재조합 단백질의 결여는 외생 첨가 mRNA의 번역을 위해 새로 제조 Xenopus의 계란 추출물의 고용량을 활용 관심 단백질을 코딩하는 전 사체의 첨가에 의해 극복 될 수있다. 단백질 분해의 규제는 많은 세포 경로의 조절에 중요합니다 21. Xenopus의 계란 추출물이 시스템은 전사와 번역의 혼란의 영향없이 단백질 회전율을 모니터링 할 수있는 여러 가지 방법에 대해 허용하는 단백질 분해를 연구하기 위해 광범위하게 사용되어왔다을 처리합니다. Wnt 신호 전달 경로 개발과 질병에 중요한 역할을 담당하고 매우 보존 신호 통로입니다. β-카테닌,이 Wnt 경로의 주요한 효과기의 회전율은 매우 증가 된 정상 상태 L에게 규제되고,β-catenin이의 거시기는이 Wnt 표적 유전자의 활성화를 위해 중요합니다. β-catenin의 분해의 중요성은 β-catenin의 분해를 억제로 Wnt 경로에 돌연변이가 ~ 대장 암 (22)의 모든 산발적 인 케이스의 90 %에서 발견되는 사실에 의해 강조 표시됩니다. 이 Wnt 경로의 구성 요소에 의한 β-catenin의 저하가 충실히 매출의 메커니즘을 연구 할뿐만 아니라 분해 2, 19, 20, 23 ~ 29의 새로운 작은 분자 변조기를 식별하는 Xenopus의 계란 추출물에 효과적으로 요약 할 수있다. 세포주기를 공부 Xenopus의 계란 추출물의 제조 방법은 이전 조브 공보 30-32에 기술되었다. 현재 프로토콜은 이러한 방법의 변형을 설명하고의 분해에 최적화되어 있습니다 [35 S] - 방사성 표지 된 β-catenin의와 루시 페라 제 - 태그 β-catenin이있는Xenopus의 계란 추출물. 방사성 동위 원소 분해 분석은 오토 라디오를 통해 단백질 수준을 직접 시각화 할 수 있습니다. [35 S] 메티오닌이어서 직접 분해 반응에 첨가 될 수있는 시험 관내 번역 반응을 사용하여 관심의 단백질에 도입된다. 또한, 방사성 표지 단백질 회전율 분석은 단백질 안정성에 영향을 미칠 수있는 그 단백질 또는 에피토프 태그에 대한 항체를 요구하지 않는다. 단백질 수준에서도 작은 변화, 방사성 표지 된 단백질 밴드의 강도의 변화에 반영 용이 오토 라디오 그래피에 의해 시각되므로 [35 S]를-방사성 표지 분해 분석은 단백질 회전율이 시각화를위한 매우 유용한 방법을 나타낸다. 순서 반딧불 루시페라아제에 β-카테닌의 퓨전 (이하, 간단히 「루시퍼 &quot;라 함), 단백질 수준의 정밀하고 손쉬운 정량적 측정을 허용β-catenin의 회전율 19, 20의 운동 특성을 결정합니다. 루시퍼 라제 분석의 주요 장점은 쉽게 확장되어 강한 양적 시스템을 제공한다는 것이다. 다음 프로토콜은 β-catenin의 분해 및 신규 β-catenin의 변조기의 높은 처리량 검사를위한 강력하고 효율적이며 효과적인 방법을 시금위한 간단한 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>임산부 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)</td><td>ProSpec</td><td>hor-272-A</td><td>사용 전 증류수로 재구성.</td></tr><tr><td>인간 융모성 성선 자극 호르몬</td><td>시그마</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>피셔</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>연구 제품 국제</td><td>S23020-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>피셔</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>아크로스 유기물</td><td>AC42352-5000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Acros Organics</td><td>AC17360-1000</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>Sigma</td><td>A1153-10MG</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴</td><td>Sigma</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C8273-10MG</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 주사기: Luer Lock tip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>27 G 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96 잘 단단한 백색 폴리스티렌 microplate, 둥근 바닥</td><td>Corning</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo luciferase 분석 체계</td><td>Promega</td><td>E2520</td><td>-80 &deg에 장기 저장; C, -20 &deg에서 최대 1개월 동안 저장할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>TNT Sp6 결합 망상적혈구 용해물 시스템</td><td>Promega</td><td>L4600</td><td></td></tr><tr><td>TNT Sp6 고수율 밀 배아 단백질 발현 시스템</td><td>Promega</td><td>L3260</td><td>일반적으로 망상적혈구 용해물보다 수율이 높음&nbsp;</td></tr><tr><td>EasyTag Express 단백질 라벨링 믹스 [S35]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772007MC</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 포스페이</td>트 <td>Sigma</td><td>27920-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td></td><td>Sigma A2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 포스포키나제</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo 루시페라제 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E2920</td><td>Steady-Glo</td></tr><tr><td>50ml 원심분리기 튜브</td>와 동일한 보관 조건 <td>Fisher Scientific</td><td>0556214D</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SS-34 고정각 로터</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>115V 50/60Hz 미니 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-128</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-firefly luciferase 항체</td><td>Abcam</td><td>ab16466</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GSK3 항체</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610201</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &deg; C 인큐베이터</td><td>Percival Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

β-catenin의 저하의 재구성<em&gt; xenopus의</em&gt; 계란 추출

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

는 Xenopus laevis의 계란 추출물. Xenopus의 계란 추출물이 세포주기 및 신호 전달 경로 1-3 포함하여 많은 세포 맥락에서 단백질 회전율을 연구하는 데 사용 된 다양한 세포 과정의 생화학을 공부 잘 특징으로, 강력한 시스템입니다. 여기서, 방법이 중요한로 Wnt 경로의 구성 요소, β-catenin의의 분해를 촉진하기 위해 최적화 된 Xenopus의 계란 추출물을 분리에 설명되어 있습니다. 두 가지 방법은 Xenopus의 계란 추출물에서 β-카테닌 단백질 분해를 평가하기 위해 설명되어 있습니다. 다른 하나는보다 쉽게 높은 처리량 분석 (반딧불 루시 페라 제 - 태그 융합 단백질)에 대해 조정하는 동안 한 가지 방법은, ([35 S] - 방사성 표지 단백질) 시각 정보를합니다. 설명 된 기술은 β-카테닌 단백질 회전율을 평가하고 해당 매출에 공헌 분자 구성 요소를 식별하는 데 사용될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한 ABIL루시 페라 제 - 태그 단백질의 양적 및 손쉬운 판독과 함께 균일 한 Xenopus의 계란 추출물의 큰 볼륨을 정화하는 ITY이 시스템은 쉽게 β-catenin의 분해 변조기에 대한 높은 처리량 검사에 적용 할 수 있습니다.

Xenopus의 계란 추출물의 β-catenin의 저하의 회로도는 그림 2A에 표시됩니다. 35 S 표지 β-catenin의이 Xenopus의 계란 추출물에 배양, 분취 량 (1 ML 상당 추출) 적절한 시간에 제거하고 샘플을 실시 하였다 SDS-PAGE는 오토 라디오 그래피 하였다. 이 Wnt 경로의 구성 요소에 의한 β-catenin의 분해는 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (2)에 의해 매개되며, Xenopus의 추출물 [35 S] - 방사성 표지 된 β-catenin의 저하는 프로 테아 좀 억제제 MG132 그림 2B의 첨가에 의해 억제된다. 이 Wnt 경로의 구성 요소에 의한 β-catenin의 저하는 GSK3 (34)에 의해 인산화에 따라 달라집니다. 제노의 안정화 1) β-catenin의 (SA) 돌연변이 (GS...

방법은 Xenopus의 계란 추출물 및 단백질 분해의 저분자 변조기에 대한 고 처리량 스크리닝을 위해 그 적응 방사성 표지와 루시퍼 라제 융합 단백질을 이용하여 단백질 분해 분석에 대해 설명한다.

β-catenin의 저하의 재구성<em&gt; Xenopus의</em&gt; 계란 추출

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

다음 실험의 전반적인 목표는 무세포 생화학적 제노푸스(xenopus) 난자 추출물 시스템을 사용하여 beta-catenin의 턴오버를 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 활성화된 xip 난자 추출물에 의심되는 이펙터를 첨가하거나 제거함으로써 beta-catenin 턴오버의 조절 인자를 식별합니다. 두 번째 단계로, S 35로 방사성 표지되었거나 루시페라아제(luciferase)와 융합된, 시험관 내에서 전사 및 번역된 외인성 beta-catenin을 XUS 난자 추출물에 첨가하며, 이는 천연 조건 하에서 활발하게 분해됩니다. 그다음, 시간별로 시료를 수집하여 시간에 따른 beta-catenin 단백질 수준의 변화를 평가합니다.자가방사법 및/또는 발광 검출을 바탕으로, 제노푸스(xenopus) 난자 추출물의 특정 조절이 beta catenin의 합성 및 분해 속도를 증가시키는지 또는 감소시키는지 보여주는 결과가 도출됩니다. 배양 세포에서의 펄스-체이스(pulse chase) 또는 사이클로헥시미드-체이스(cycloheximide chase) 실험과 같은 기존의 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 장점은, 제노푸스 난자 추출물이 단백질 수준에서 단백질 조절을 분석할 수 있는 무세포 생화학 시스템을 제공하며, 활성 전사로 인한 추가적인 복잡성이 없다는 점입니다. 이 방법은 beta catenin과 같은 핵심 신호 전달 단백질의 조절 인자를 식별함으로써 신호 전달 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.제노푸스(xenopus) 추출물을 사용하면 경로의 구성 성분을 쉽게 고갈시키고 정의된 양의 단백질을 다시 추가할 수 있습니다. 용량 의존적 효과를 결정하려면, 갓 준비한 XUS 난자 추출물을 사용하거나 냉동된 추출물을 빠르게 해동하여 얼음에 놓으십시오. 모든 조작은 저온에서 수행하며, 추출물의 희석을 최소화하기 위해 펠렛 형태의 항체 또는 친화성 비즈를 추출물 부피의 1/10로 준비하고, 추출물을 추가하기 전에 비즈에서 액체를 최대한 제거하십시오.길게 테이퍼진 끝단이 있는 젤 로딩 팁을 사용하여 추출액을 GST 결합 레진에 첨가합니다. 추출액-비드 혼합물을 4 °C에서 1시간 동안 회전시킵니다. 그 다음, 마이크로 원심분리기를 사용하여 추출액-비드 혼합물을 4 °C에서 12,600 Gs로 30초 동안 원심분리합니다.추출물과 함께 비드가 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 고갈된 추출물을 얼음 위에 놓

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

원유 및 fractionated Xenopus 달걀 추출물은 형태학의 및 생화 학적 분석을위한 세포 프로세스를 reconstituting을위한 재료를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 계란 용해 및 차등 원심 분리가에 차례로 fractionated 추출물과 가벼운 막 준비를 준비하는 데 사용되는 원유 추출을 준비하는 데 사용됩니다.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

핵 막 어셈블리는 세포 분열주기에서 중요한 단계이며이 과정은 Xenopus의 정자 염색질, cytosol, 가벼운 멤브레인 분수를 결합하여 시험관에서 복제하실 수 있습니다. 완료 핵은 기공 단지와 함께 핵 세포막을 포함하여 형성하고, 이러한 재구성 핵 정상 핵 프로세스의 수입니다.

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

이 비디오 프로토콜은 유전자 변형을 생성하는 방법을...

트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.

사용하여 DNA의 손상 세키의 연구<em&gt; Xenopus</em&gt; 달걀 압축을 풉니 다

우리는 살려서 살짝 익히고의 컬렉션을...

생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

고도로 압축된 유사분열 염색질의 축합의 분자 메커니즘은 잘못 정의되어 있습니다. 당사는 HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물에서 분리한 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 응축 과정을 충실하게 재구성하는 cell-free 분석을 제시합니다.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

세포 및 세포 내 스케일링의 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. Xenopus 배아 추출물의 사용은 세포 기관 크기 조절의 메커니즘을 밝히기 위해 점점 더 보편화되고 있습니다. 이 방법은 배아 추출물 준비와 핵 크기 조절 메커니즘을 확인할 수 있는 새로운 핵 스케일링 분석을 설명합니다.

사용하여 셀 - 무료 분석<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em&gt; 배아 핵 크기 규제의 메커니즘을 연구하기 위해 추출

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

우리는 Xenopus laevis 알에서 희석되지 않은 세포질 추출물의 제조 및 라이브 이미징 방법을 설명합니다.

제노푸스 라에비스 동적 세포질 조직을 시각화하기 위한 계란 추출물 준비 및 라이브 이미징 방법

배우세요 Xenopus 계란 추출물을 이용한 β-catenin 단백질 분해 분석 방법입니다. 이 기술은 세포 신호 전달 연구에서 단백질 조절 메커니즘을 효율적으로 규명하는 데 활용됩니다.

β-catenin의 저하의 재구성

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