β-catenin의 저하의 재구성 Xenopus의 계란 추출

방법은 Xenopus의 계란 추출물 및 단백질 분해의 저분자 변조기에 대한 고 처리량 스크리닝을 위해 그 적응 방사성 표지와 루시퍼 라제 융합 단백질을 이용하여 단백질 분해 분석에 대해 설명한다.

다음 실험의 전반적인 목표는 cell-free biochemical xenopus 난자 추출물 시스템을 사용하여 회전율이 높은 베타 고양이를 분석하는 것입니다. 이는 먼저 활성화된 xip 난자 추출물에 의심되는 효과기를 추가 및/고갈시켜 베타-카테닌 전환의 조절인자를 시험관 내 외인성 2단계 조절체로 식별하고, S 35로 무선 표지되거나 루시페라아제와 융합된 베타-카테닌을 S 35로 무선 표지하거나 루시페라아제와 융합하여 XUS 난자 추출물에 첨가함으로써 달성되며, 이는 네이티브 조건에서 활발하게 분해됩니다. 다음으로, 시간 경과에 따른 베타 카틴과 단백질 수치의 변화를 평가하기 위해 시점을 수집합니다.

xenopus 난자 추출물의 특정 조절이 자동 방사선 촬영 및/또는 발광 검출을 기반으로 베타 카틴 및 분해 속도를 증가 또는 감소시키는지 여부를 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 배양된 세포에서 펄스 추적(pulse chase) 또는 고리 하이데 추적(cycl heide chase) 실험과 같은 다른 기존 방법에 비해 이 기술의 장점은 제노푸스 난자 추출물이 단백질 수준에서 단백질 조절을 분석할 수 있는 무세포 생화학적 시스템을 제공하고 활성 전사의 복잡성을 추가하지 않는다는 것입니다. 이 방법은 베타 카티나(beta catina)와 같은 주요 신호 단백질의 조절자를 식별하여 신호 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

xenopus 추출물로 작업하면 사용자는 경로의 구성 요소를 쉽게 고갈시키고 정의된 양의 단백질을 다시 추가할 수 있습니다. 복용량에 따른 효과를 확인하려면 갓 조리한 XUS 난자 추출물을 사용하거나 빠르게 해동하고 냉동 추출물을 얼음 위에 올려 놓습니다. 추위에서 모든 조작을 수행하고, 추출물의 희석을 최소화하기 위해 추출물의 10분의 1 부피에서 펠릿화된 항체 또는 친화성 비드를 준비하고, 추출물을 첨가하기 전에 비드에서 가능한 한 많은 액체를 회수합니다.

끝이 가늘어지는 긴 젤 로딩 팁을 사용하여 여기에서 추출물을 GST 결합 수지에 첨가합니다. 추출물 비드 혼합물을 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전시킵니다. 그런 다음 30초 동안 섭씨 4도의 마이크로 퍼지에서 12, 600Gs로 추출물 비드 믹스를 회전시킵니다.

추출물과 함께 구슬이 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 고갈된 추출물을 얼음 위의 새 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 고갈된 추출물과 비드 모두의 면역 블로팅(immuno blotting)에 의한 고갈 효율을 확인합니다.

T와 열화는 에너지에 의존하기 때문에 내인성 A TP 저장을 빠르게 고갈시킵니다. 따라서 강력한 T 분해를 유지하려면 에너지 재생 혼합물을 사용해야 합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 20배 에너지 재생 또는 ER 믹스를 준비합니다.

얼어붙은 튜브를 두 손으로 문질러 오푸스 난자 추출물을 빠르게 해동합니다. 추출물이 모두 녹기 직전에 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 10마이크로리터의 에너지 재생을 추가합니다.

xenopus 계란 추출물의 분취액에 섞습니다. 튜브를 빠르게 튕겨 완전히 섞고 펄스 소용돌이 펄스 스핀을 펄스하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 분해 분석을 위한 적절한 부피를 얼음 위의 사전 냉각된 마이크로 fuge 튜브에 분취합니다.

무선 표지된 베타 카틴 및 분해 분석을 준비하려면 각 시점마다 2-5마이크로리터의 추출물을 회수하여 XUS 난자 추출물에서 무선 표지된 베타-카테닌 분해 분석을 수행합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 beta-catenin이라고 표시된 라디오를 준비합니다. 그런 다음 튜브를 빠르게 튕기고 볼텍싱의 짧은 펄스로 얼음 혼합물에 xip 반응 혼합물 20 마이크로 리터에 체외로 번역 된 베타 카테닌 1-3 마이크로 리터를 첨가하십시오.

이것은 중요한 단계입니다. XUS 계란 추출물은 점성이 매우 높으며 불완전한 혼합은 결과 펄스, 스핀 및 얼음 위에 놓는 결과의 일관성에 영향을 미칩니다. 지정된 시점에 튜브를 실온으로 이동시켜 베타-카테닌 분해 반응을 시작합니다.

1-5 마이크로 리터의 샘플을 제거하고 즉시 5 x 부피의 SDS 샘플 버퍼와 혼합하여 반응을 중지하고 분해 반응이 완전히 종결되었는지 확인하십시오. 튜브를 여러 번 튕기고 격렬하게 소용돌이하여 SDS 페이지를 수행합니다. 자동 방사선 촬영은 레인당 각 시점에 대해 추출물의 1마이크로리터 상당을 실행합니다.

결과는 image, J image quant 또는 다른 선호되는 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화할 수 있습니다. xap 난자 추출물에서 베타-카테닌의 분해는 대역 내 베타 케인으로 표시된 라디오의 강도가 시간에 따라 감소하는 것으로 입증되어야 합니다. 베타-카테닌 루시퍼라아제를 준비하기 위해, 방사성 표지되지 않은 루시페라아제 태그가 지정된 베타-카테닌을 합성합니다.

완전한 아미노산 혼합과 함께 전사 번역 결합 시스템을 사용합니다. 반응의 0.5에서 1마이크로리터까지 루시페라제 활성을 측정하여 루시페라제 태그가 지정된 베타-카테닌의 생산을 확인합니다. 베타 카틴 루시페라아제 분해 분석을 수행하기 위해 번역되지 않은 반응 혼합물에서 발광을 측정하여 배경 발광을 평가합니다.먼저 해동하고 이전과 같이 xenopus 난자 추출물을 준비합니다.

그런 다음 시험관에서 번역된 베타 카틴과 루시페라제 융합을 준비된 xip 반응에 추가합니다. 얼음에 섞어 잘 섞는다. 이전과 마찬가지로 추출물을 실온으로 옮겨 분해 반응을 시작합니다.

표시된 시점에 반응의 부분 표본을 제거하고 액체 질소에서 스냅 동결합니다. 각 시점에서 분석을 위해 3개의 샘플을 제거합니다. 냉동 추출물은 분석할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.

얼음 위에서 샘플을 해동하고 처리하기 전에 샘플을 얼음 위의 표준 흰색 96웰 플레이트로 옮깁니다. 루시페라아제 활성의 경우, GS GSK 베타-카테닌의 3가지 의존성 분해는 XUS 난자 추출물을 사용하여 여러 가지 방법으로 쉽게 입증할 수 있습니다. XUS 추출물에서 S 35 방사 표지 베타 카테닌의 분해는 프로테아솜 억제제 MG 1 32의 첨가에 의해 억제됩니다.

베타-카테닌 돌연변이는 야생형 베타인과 비교하여 XUS 난자 추출물에서 안정화되어 있으며, GSK 3의 단백질 억제제는 베타-카테닌의 분해를 유사하게 억제합니다. 마지막으로, xip 난자 추출물에서 GSK 3의 고갈은 베타 카테닌의 분해를 억제합니다 분해는 외인성 GSK 3를 첨가하여 구제 할 수 있습니다. xip egg 추출물의 beta-catenin luciferase 분해 분석법을 사용하여 베타 카틴 및 루시페라아제의 분해를 평가했습니다.

베타 카틴(beta katine)과 루시퍼라아제(luciferase)의 분해 속도는 태그가 지정되지 않은 베타-카테닌 단백질(beta-catenin protein)과 유사합니다. 베타 카틴(beta katine)과 루시페라아제 융합(luciferase fusion)에 대한 분해 조절은 비융합 단백질과 본질적으로 동일합니다. 염화 리튬의 첨가는 베타 카틴과 루시페라아제의 회전율을 억제하는 결과를 낳았기 때문에 베타 카티나의 방사성 신호에서 변화를 일으켰습니다.

루시페라제 단백질은 이 절차를 시도하는 동안 시간 경과에 따른 루시페라제 효소 활성의 변화와 유사합니다. 이 분석을 시도하기 전에 모든 시약을 얼음 위에 보관하고 반응을 철저히 혼합하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 cell-free xenopus 난자 추출물 시스템을 사용하여 조절자를 식별하고 베타 카틴 및 회전율을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.