트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

이 실험의 전반적인 목표는 단일 분자 수준에서 이중 가닥 DNA 분자의 비틀림 변형 또는 변화를 직접 측정하는 것입니다. 이는 첫 번째 분석에서 자유 궤도 자기 핀셋 또는 썸핑이라고 하는 두 가지 분석을 사용하여 수행됩니다. 기능화된 단일 DNA 분자는 자기 비드와 유리 표면 사이에 묶여 있습니다.

원통형 모양의 자석이 DNA를 늘리는 힘을 가하는 동안 이 구성에서 비드의 각도 위치는 자석이 아닌 테더링된 DNA에 의해서만 제한되므로 빨간색 화살표로 표시된 비드 회전이 비드 원인의 DNA 회전 열 변동의 비틀림 변화를 보고할 수 있습니다. 그것의 XY 위치는 원형 고리 또는 도넛에 놓입니다. 이 XY 위치를 회전 각도로 변환하면 자기 토크 핀셋이라고 하는 두 번째 관련 분석에서 테더링된 DNA의 비틀림 변화를 모니터링할 수 있으며, MTTA 측면 자석이 주 원통형 자석에 추가되어 비드 각도 운동을 제한할 수 있습니다.

이 자석 구성을 사용하면 자석 어셈블리의 간단한 회전을 통해 테더링된 DNA 분자에 외부 토크를 가할 수 있으며, 초기의 비틀림 완화 구성과 비교하여 여러 차례 회전을 가한 후 비드 각도 위치의 편차를 측정하고, 비드를 가두는 마그네틱 트랩의 강성 보정을 통해 외부 토크를 적용할 수 있습니다. 각도 운동은 DNA의 토크 축적을 정량화하는 것을 가능하게 합니다. 기존 자기 핀셋에 비해 글꼴과 MTT를 사용하는 주요 이점은 핵산의 비틀림과 토크의 변화를 직접 측정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 외부 힘과 토크에 대한 DNA와 RNA의 반응을 매핑할 수 있도록 하여 DNA와 RNA의 역학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 DNA와 단백질의 상호 작용을 조사하는 것까지 확장됩니다. 예를 들어, DNA 복구 저장 또는 전사를 담당하는 단백질이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 기존의 자기 핀셋 설정을 얼마나 쉽게 수정하여 새로운 기능을 제공할 수 있는지 보여줍니다. 다음 실험에 사용된 설정은 기존의 자기 핀셋 설정을 기반으로 합니다.

그 중심에는 LED에 의해 위에서 조명되고 아래에서 현미경 대물렌즈와 CCD 카메라를 통해 이미지화되는 플로우 셀이 있습니다. 플로우 셀 위에는 컴퓨터 제어 모터를 사용하여 위아래로 이동하고 회전할 수 있는 자석 헤드가 있습니다. CCD 카메라의 이미지는 맞춤형 랩 뷰 소프트웨어에 의해 실시간으로 분석되어 DNA 테더링 비드의 X, Y 및 Z 위치를 결정합니다.

맞춤형 랩 뷰 소프트웨어는 요청 시 작성자가 제공합니다. DNA가 테더링된 마그네틱 비드로 플로우 셀을 준비한 후 기존 마그네틱 핀셋에 장착하고 참조 비드에 고정된 표면과 적절한 길이의 개별 DNA 분자가 테더링된 비드를 모두 선택합니다. 설정이 글꼴 모드로 변환될 수 있습니다.

기존 핀셋 구성을 위해 자석을 고정하는 전체 자석 헤드의 나사를 수동으로 푸는 것으로 시작합니다. 글꼴용 원통형 자석을 고정하는 자석 헤드로 교체하십시오. F에 사용되는 원통형 자석을 자석 헤드에 배치하는 동안 선택한 DNA 테더를 시야 내에 유지해야 합니다.

이 절차의 가장 어려운 부분은 양식 형상에 대한 자석을 올바르게 정렬하는 것입니다. 자석을 체계적으로 움직이고 모든 단계 후에 정렬을 테스트하여 좋은 정렬을 얻을 수 있으며, 이를 시연할 것입니다. 이제 위치 단계를 사용하여 글꼴에서 자석의 코스 정렬을 수행하여 랩 뷰 소프트웨어에서 자석을 수동으로 이동합니다.

기록 버튼을 클릭하여 XY 위치 변동 또는 편위를 측정합니다. 기록된 트레이스는 실시간으로 화면에 표시되며 X, Y, Z 위치 정보가 포함된 텍스트 파일로 저장됩니다. XY 편위가 그림과 같이 호를 따르는 경우 원통형 자석이 제대로 정렬되지 않은 것이므로 원통형 자석을 적절한 방향으로 계속 이동하고 XY 변동이 코스 정렬이 달성되었음을 나타내는 완전한 원형 패턴을 추적할 때까지 측정을 수행합니다. 다음.

추가 실험에 필요한 경우, 고분해능 자동 스테이지를 사용하여 플로우 셀을 이동시키고 원통형 자석을 비드에서 약 10미크론 이내로 정렬하여 글꼴을 미세 정렬합니다. 그런 다음 이전과 마찬가지로 XY 일탈을 기록합니다. 원형 고리의 변동이 거의 균일해질 때까지 스테이지를 계속 이동하고 이탈을 기록합니다.

최종 정렬을 확인하려면 요청 시 작성자가 제공하는 MATLAB 스크립트를 사용하여 히스토그램 또는 서모그램의 변동을 플로팅하고 균일성을 검사합니다. DNA 토크를 측정하려면 글꼴에 사용되는 원통형 자석을 제거하고 원통형 자석과 영구 측면 자석으로 교체하십시오. MTT의 경우 선택한 DNA 테더가 시야 내에 남아 있는지 확인합니다.

제어 실험실 보기 소프트웨어의 해당 패널에 자기 회전의 수와 속도를 입력합니다. 여기. 회전 수는 5로 설정되고 속도는 0.1헤르츠로 설정됩니다. 이렇게 하면 측정하는 동안 자석이 천천히 회전합니다.

다음으로, MATLAB에서 XY 위치 모니터링을 기반으로 하는 각도 추적 스크립트를 사용하며, 이 스크립트는 요청 시 작성자가 제공합니다. 각도 변동을 시간의 함수로 표시하는 플롯, theta T가 나타납니다. 랩 보기에서 모든 것이 설정되면 녹화 버튼을 클릭합니다.

추적은 이전과 같이 실시간으로 나타납니다. MATLAB에서 MATLAB 스크립트를 사용하여 각도 신호에 대한 가우스 피팅으로 각도 세타 T 및 비드 높이 Z of T 트레이스에 대한 플롯을 화면에 생성하여 각도 변동의 표준 편차를 확인합니다. 시그마 세타.

이 스크립트는 각도 변동의 분산에서 비틀림 트랩의 강성을 직접 결정합니다. 시그마 세타의 제곱(라디안)입니다. 여기에 표시된 공식을 사용하면 MTT에서 라디안당 10-1000 피코 뉴턴 나노미터의 회전 트랩 강성을 달성하는 것이 일반적이며, 이는 기존 자기 핀셋보다 훨씬 낮습니다.

예를 들어, 여기에서 회전 트랩 강성을 라디안당 약 52피그 나노미터로 결정했습니다. 기존 자기 핀셋과 비교했을 때 자기 토크 핀셋의 회전 트랩 강성은 단일 분자 토크 측정에 적합하지만 발휘할 수 있는 최대 토크가 감소한다는 것을 의미하기도 합니다. 이는 MTT가 급격한 회전으로 인한 드래그 토크의 균형을 맞출 수 없음을 의미합니다.

따라서 너무 빨리 회전하지 않도록 주의해야 합니다. 우리는 일반적으로 약 0.1헤르츠의 속도로 회전합니다. 다음으로, DNA 테더는 자석을 천천히 회전시키고 설정된 회전 횟수를 기록하여 압도하고 각도 변동의 또 다른 흔적을 기록하여 자석 회전 횟수와 속도를 제어 실험실 보기 소프트웨어의 해당 패널에 다시 입력합니다.

여기서 회전 수는 40으로 설정되고 속도는 0.1헤르츠로 설정됩니다. 이것은 핵산 밧줄에 축적된 토크를 결정하기 위해 측정하는 동안 자석이 천천히 회전하게 합니다. N턴 후, 우리는 여기에 표시된 공식을 사용하며, 여기서 꺾쇠 괄호는 평균과 세타 0을 나타냅니다.

그리고 세타 N은 비틀림이 완화된 테더와 회전에 각각 해당하는 0회전의 각도입니다. 자석이 회전하는 단계를 반복하고 필요에 따라 각도 변동의 고원을 기록하여 단일 측정 실행에서 분자의 토크 반응을 완전히 결정합니다. 이중 가닥 DNA에 대한 결합이 길어지고 풀리는 복구 단백질 RAD 51에 의해 유도된 DNA의 비틀림 변화를 측정합니다.

DNA rad 51은 글꼴에 묶인 DNA 분자에 추가되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 비드는 나선형 궤적을 추적합니다. 이 움직임은 시간이 지남에 따라 DNA가 어떻게 길어지고 풀리는지를 설명하는 구성 요소로 분리될 수 있습니다.

MTT를 이용하여 DNA에 저장된 토크를 측정하기 위해 인가된 회전 횟수마다 체계적으로 과감백과 감긴 분자와 각도 변동을 측정하였다. 각도 트랩 강성에 대해 보고하는 각도 변동의 표준 편차는 적용된 회전 수와 독립적이어야 합니다. 여기서 표준 편차는 여기에 표시된 것처럼 약 9도입니다.

각도 위치의 평균은 일정한 각도 트랩 강성을 사용하여 적용된 회전 수에 따라 체계적으로 변경됩니다. 평균 각도의 변화는 토크로 변환되어 DNA에 저장된 토크와 적용된 회전을 산출합니다. 비드 Z 위치를 동시에 기록하면 DNA의 길이와 적용된 회전을 얻을 수 있습니다.

이 두 곡선은 함께 과권선 및 과감 권선에 대한 DNA의 완전한 기계적 반응을 생성합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 자유롭게 궤도를 도는 자기 핀셋과 자기 토크 핀셋을 사용하여 생물학적 분자를 측정, 비틀림 및 토크하는 방법을 잘 이해하게 되어 기존 자기 핀셋을 쉽게 적용할 수 있는 새로운 단일 분자 분석을 얻을 수 있습니다. 이러한 기술의 개발은 예를 들어 DNA 또는 RNA의 비틀림 특성을 연구하고 DNA 압축 및 복구와 같은 과정을 관찰하기 위한 생물 물리학 분야의 연구를 위한 길을 열었습니다.글꼴 및 MTT 기술은 테더링된 DNA에서 단백질의 특정 위치를 결정하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 형광 검출과 같은 다른 방법으로 향상될 수 있습니다.