설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 정자 세포 성숙 동안 정자 내에서 발생하는 포스포 펩타이드 변화를 정량화하는 것입니다. 이것은 마우스에서 coddle epididymus를 제거하고, 정자 세포를 역행하여 역행하고, 세포를 미세 모세관 튜브에 모으는 방식으로 이루어집니다. 다음으로 정자 세포는 오염된 단백질을 제거할 수 있는 균형 잡힌 소금 용액으로 헤엄쳐 나와야 하며, 그런 다음 오염된 염분과 지방을 제거하기 위해 씻고 눕히고 침전시킵니다.

gular 단백질은 트립신을 사용하여 소화된 다음 phospho 펩타이드를 농축하기 위해 이산화 티타늄을 사용하여 농축됩니다. 결과는 액체 크로마토그래피, 질량 분석 분석을 기반으로 단백질의 인산화 상태의 정량적 변화를 보여줍니다. 이 방법은 정자가 EPI를 통과할 때 또는 수용 중에 인산유전학적 변화가 무엇인지와 같은 생식 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 정자 세포 생물학에 대한 통찰력을 제공했지만 모델 유기체, 암과 같은 질병 연구, 신경 병리학 및 일반적인 신호 전달 경로에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 EPI가 조작될 영역의 해부학적 구조를 결정하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 캐뉼러를 만들기 위해 Milli Q 물 1리터에 다음을 추가하여 200ml의 Biggers, Whitten 및 Whitten 또는 BWW 작업 줄기 용액을 만드는 것으로 시작합니다.

내부 및 외부 직경이 각각 0.4mm 및 1.1mm인 폴리에틸렌 튜브를 사용합니다. 튜브가 녹기 시작할 때까지 약한 불로 유지하십시오. 즉시 튜브의 끝을 바깥쪽으로 당겨 늘리면 외경이 줄어듭니다.

튜브를 절단하여 한쪽 끝이 좁아지면 S 딘을 더 쉽게 캐뉼레이션할 수 있습니다. 반대쪽 끝을 약 15cm로 자릅니다. 그런 다음 뭉툭한 끝 부분에 30게이지 바늘을 삽입하고 완전히 접힌 3mm 주사기를 부착합니다.

20cm 길이의 PE 튜브를 절단하여 흡입 마우스피스를 만들고 캐뉼라의 한쪽 끝에 삽입합니다. 마이크로 모세관 유리관 홀더와 유리 마이크로 모세관을 삽입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시킨 후 음낭을 작게 절개하여 epi를 노출시킵니다.

그런 다음 한 쌍의 시계 제작자를 사용하십시오. 고환과 부고환을 구멍 밖으로 빼내기 위한 5번 겸자. kata epididymus에서 약 1-2cm의 광대 한 경의를 제외한 모든 것을 제거하기 위해 자릅니다.

그런 다음 부고환과 고환을 연결하는 근위부 이비인후관과 조직을 절단하고 5배에서 40배 배율을 사용하여 해부 현미경으로 전체 남성 생식 트랙을 제거합니다. 캐뉼라의 좁아진 끝에서 1-2cm를 시야에 놓고 테이프를 사용하여 5 번 인 시계 제작자의 집게로 고정합니다. 광대 한 경의의 양쪽을 부드럽게 잡고 캐뉼라의 보이는 부분 위로 당깁니다.

그런 다음 흡수되지 않는 검은색 꼰 처리된 실크로 시계 제작자를 사용하여 캐뉼러 조직 주위에 단단히 매듭을 묶습니다. 숫자 5 겸자. kata epi ides의 말단 끝을 잡고 tunica Eugenia를 제거합니다.

하나의 표피세뇨관을 노출시키려면 세뇨관을 부드럽게 노출시키고 분리하여 정자가 방출될 수 있는 구멍을 만듭니다. 그런 다음 주사기의 플런저를 부드럽게 눌러 광활한 경향으로 공기를 배출합니다. 압력은 정자가 부러진 세뇨관에서 빠져나오게 합니다.

그런 다음 마우스피스에 흡입을 가하여 정자를 유리 모세혈관으로 끌어들입니다. 마우스피스에 부드럽게 바람을 불어넣거나 주사기를 부착하고 유리 모세혈관에서 정자를 1밀리리터의 전쟁 전 B WW 용액으로 배출합니다. 그리고 오염시키는 단백질을 제거하기 위해 세포를 세 번 씻는 용액을 사용하십시오.

최종 세척을 제거한 후 나중에 사용하기 위해 정자를 동결하거나 4% chaps, 2개의 몰 티오 요소 및 50 밀리몰 트리스 pH 7.4를 사용하여 간헐적 소용돌이로 1시간 동안 배양하는 단백질을 용해시킵니다. 다음 10, 20 분 동안 000 GS에 해결책을 분리기하고 이황화 결합을 감소시키고 단백질 해결책에 10 millimolar의 마지막 농도에 DTT에 단백질을 알킬레이트하기 위하여 새로운 관으로 상등액을 옮깁니다. 소용돌이치고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 50 밀리몰의 IO 아세트아미드를 용해물 소용돌이에 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 단백질을 침전시키려면 1부피의 용해물, 1부피의 메탄올, 0.5부피의 클로로포름을 결합하십시오. 표본을 와동 치기 후에, 10, 2 분 동안 000 Gs에 그것을, 모으고, 공용영역을 흡인하는 것을 피하기 위하여 대략 2 밀리미터를 남겨두는 최상층을 모으십시오.

메탄올 1량을 첨가한 후 튜브를 부드럽게 뒤집고 다시 회전시킵니다. 상등액을 버리고 펠릿을 3-4분 동안 자연 건조시켜 트립신, 분해 및 포스포 펩타이드 농축을 수행합니다. 1 몰 요소를 포함하는 25 밀리 몰 중탄산 암모늄을 사용하여 시작하십시오.

트립신을 재구성하려면 F를 50 대 1 중량당 단백질과 트립신의 비율로 결합하고 온도 믹서에서 섭씨 37도 및 700RPM으로 밤새 배양합니다. 회전하여 소화되지 않은 물질을 펠릿으로 만든 후 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 제조된 DHB 완충액을 사용하여 trys inized 펩타이드를 10배로 희석하고 배양 후 실온에서 1시간 동안 회전체에서 배양하는 건조 이산화티타늄 비드 200마이크로그램에 적용하고, DHB 완충액을 사용하여 샘플을 한 번 더 세척한 후 80%A CN 및 2%TFA로 구성된 세척 버퍼를 사용하여 샘플을 세 번 세척한 후 최종 원심분리 후 포스포 펩티드를 용리합니다. 2.5% 수산화암모늄을 방사 및 회수한 직후 상등액을 첨가합니다.

여기에서 볼 수 있듯이 0.3마이크로리터의 포름산을 사용하여 샘플을 산성화합니다. 이 프로토콜의 한 가지 장점은 정자가 분리되어 있다는 것입니다. 정지 상태에서는 많은 세포가 B WW 배지로 배출된 직후 뭉칩니다.

그러나 10분이 지나면 모달이 되고 솔루션이 균질해집니다. 이 비디오에 설명된 준비는 일반적으로 200 곱하기 10 대 6 zoa를 생산합니다. 이 그림은 AR 쥐 Cota epididymus의 정자의 순도를 보여줍니다.

시료 전처리와 관련된 한 가지 주요 문제는 트립 및 분해로 인한 수율입니다. 종종 샘플의 pH를 조정해야 하는 TCA 침전과 달리, 페놀 클로로포름 침전은 빠르고 산성화되지 않습니다: 여기에 표시된 샘플은 일반적으로 100마이크로그램의 샘플에서 볼 수 있는 단백질 펠릿입니다. 이 프로토콜의 재현성은 다음과 같습니다.

시간이 지남에 따라 나타나는 파란색 줄무늬는 C 18 나노 컬럼을 암시하는 펩타이드입니다. 모달 집단에서 아세토니트릴의 농도가 증가함에 따라 약 651.5 Daltons에 펩타이드 클러스터가 있지만 비 범위에는 완전히 없습니다. 일단 인산염 펩타이드 농축 프로토콜은 효율적인 기술입니다.

이 절차를 시도하는 동안 시료 전처리가 단백질체학에 대한 재현 가능한 결과를 얻기 위한 핵심 측면이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 방법은 당단백질을 분리하는 데 적용할 수 있으며, 이는 어떤 단백질이 단백질체의 sic acid 함량에 변화를 겪는지와 같은 추가 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.