Name: 설치류 부고환 정자의 포스 포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 설치류 부고환 정자의 포스포 펩타이드 정량 분석 방법을 통해 생식 생물학 연구를 수행하는 기술입니다. 이 방법은 정자 성숙 과정에서 단백질 인산화 변화를 정량화하여 생식 메커니즘 이해에 기여합니다.

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저자는 이 작업을 지원한 NHMRC의 경력 개발 상 및 보조금 지원 APP1066336에 감사를 표합니다.

문화 미디어와 요리 1. 준비 <ol><li> 5.54 g의 NaCl, 0.356 g의 KCl, 0.25 g의 CaCl2를, 0.162 g의 H 2 KO 4 P, 및 0.294 g의 황산 밀리 Q 물 L 1을 추가하여 비 거스 위튼과 위튼 (BWW) (17) 작업 용액 200 mL로 . 이 원액이며 개월까지 4 ℃에서 유지 될 수있다. </li><li> 스톡 용액으로부터,의 NaHCO3 420 mg의 추가 - 200 mg의 글루코스, 6mg의 피루브산 나트륨 600 mg을 소 혈청 알부민, 0.74 ml의 나트륨 락 테이트, 및 BWW 스톡 4.0 HEPES 완충액 ml를 193 ml의. 이 작업 솔루션이며 항상 사용하기 전에 날에 신선한 만든 37 ° C 평형을한다. </li><li> 캐 뉼러를하려면, 튜브가 녹기 시작하는 것이 (일반적으로 메탄올 불꽃) 등을 0.4 mm의 내부 직경 1.1 mm의 외부 직경 폴리에틸렌 (PE) 관을 가지고 약한 불로 보유. 즉시 outw 튜브를 당겨ARD는 스트레칭과 외부 직경이 좁아 확인합니다. </li><li> 정관 쉽게 삽관을 허용 한 쪽 끝이 좁아을 생산 컷. </li><li> 약 15cm에 캐 뉼러의 다른 쪽 끝을 잘라. 무딘 끝으로 30 G 바늘을 삽입하고, 그것에 3 ML의 주사기를 연결 (완전 수축). </li><li> PE 튜브 (4.2 mm 내경 6.4 mm 외경)의 20cm 길이를 절단하여 흡입 마우스 피스를 확인합니다. 한쪽에 마우스 피스를 삽입합니다. </li><li> 마이크로 유리 모세관 튜브 홀더와 유리 마이크로 모세관 자체 (전형적으로 마우스에 대한 3 μL, 쥐 40 μL)를 삽입한다. </li></ol> 마우스에서 Epididymides 2. 제거 <ol><li> 각 기관에 특정 IACUC 승인 절차에 따라 쥐를 안락사. </li><li> 동물을 가지고 부고환을 노출 음낭에 작은 절개를합니다. 시계의 # 5 포셉 한 쌍을 사용하여 캐비티에서 고환과 부고환을 당깁니다. </li><li> 이러한 적어도 1-2cm가 카우의 부고환에 부착 된 상태로 유지 정관을 잘라. 또한, 고환 부고환 접속 근위 원심성 덕트 및 조직을 절단하고, 전체 트랙의 남성 생식을 제거한다. </li><li> 5-40X의 순서로 확대 범위 해부 현미경 전체 남성의 생식 트랙을 놓습니다. </li></ol> 3. 부고환을 Cannulating <ol><li> 축소 (원추형) 끝에 1-2 센티미터 렌즈를 통해 무료로 볼 수 있도록 현미경에 캐 뉼러 아래 테이프. </li><li> 시계의 # 5 포셉 한 쌍을 가지고 부드럽게 정관의 양쪽 걸쇠와 캐 뉼러는 정관으로 진행되도록, 캐 뉼러에 정관을 당깁니다. </li><li> 비 흡수성 검은 꼰 치료 실크 (크기 5-0)의 길이를 가지고 유관 정관 주위에 매듭을 묶어. 확인 매듭이 정관 내부 캐 뉼러를 개최 단단히 당겨지면 공기 압력 FR옴 주사기 적용됩니다. </li></ol> 4. 역행 또는 꼬리 부고환 정자의 백 플러싱 <ol><li> 시계 제작자의 # 5 집게를 사용하여 카우의 epididymides의 말단부를 잡고 하나의 부고환 세관을 노출하기 위해 외막 albuginea를 제거합니다. </li><li> 포셉 사용하여 부드럽게 보이도록 가느 다란 관을 끌어와 정자가 해제 될 때까지 구멍을 만들 수 있도록 다음 떨어져 애타게. </li><li> 정관에 주사기에서 공기를 배출 할 수 있도록 조심스럽게 3 ㎖ (마우스) 20 ㎖ (쥐) 주사기에 밀어 넣습니다. 적절한 압력, 정자 천천히 카우의 부고환의 말단부에 깨진 가느 다란 관에서 나오는 시작합니다. 이때, 유리 모세관에 정자를 그릴 마우스 피스 흡입을 적용한다. 주 : 일반적으로 마우스에서, 정자 2-3 μL가 동물의 나이에 따라 얻을 수있다. 쥐 의지, 평균 수익률이 30 ~ 40 μL에. </li></ol> 5. 세척및 단백질 체학을위한 준비에 정자를 용균 <ol><li> 부드럽게 마우스 피스 불고 또는 주사기를 부착하고 모세관에서 다시 정자를 밀어하기 위해 공기를 추방하여 BWW 용액 1 ml의 용액 (37 ° C)에 유리 모세관에서 정자를 추방. </li><li> 정자 세포가 확산되면, 오염 단백질을 제거하는 1 ml의 BWW 3 배 (300 XG, 5 분)을 씻는다. 최종 세척 한 후, 상층 액을 제거합니다. 주 :이 시점에서, 정자 세포가 나중에 사용하기 위해 고정 될 수있다. </li><li> 간헐 텍싱 함께 1 시간 동안 4 % CHAPS, 2 M 티오 우레아, 50 mM 트리스, pH가 7.4를 사용하여 단백질을 가용화. </li><li> 세포를 원심 분리 (10,000 XG, 20 분) 용균 후, 상층 액을 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. 주 :이 시점에서, 단백질의 정량을 행할 수있다. </li></ol> 6. 이황화 채권 감소와 알킬화 <ol><li> 용해 단백질에 최종 농도가 10 mM의 DTT를 추가, vort전은 30 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 해물, 소용돌이에 최종 농도로 idodoacetamide의 50 mM을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li></ol> 7. 강수량 <ol><li> 메탄올 클로로포름, 해물 1 볼륨 (예를 들어 400 μL)를 추가하여 샘플을 침전 메탄올 하나의 볼륨 (400 μL) 0.5 볼륨 (200 μL) 클로로포름을 추가합니다. </li><li> 소용돌이 샘플 및 스핀 (10,000 XG, 2 분). </li><li> 두 단계 원심 분리 다음 나타납니다합니다. 상위 계층 (조심 인터페이스를 방해하지)의 모든하지만 2mm를 폐기하십시오. </li><li> 메탄올의 1 볼륨 (400 μl를) 추가, 반전 튜브는 부드럽게 (10,000 XG, 15 분) 혼합하고 다시 스핀 1-2X. 3 ~ 4 분 동안 낭비 뜨는 공기 건조 펠렛을 폐기하십시오. </li></ol> 8. 트립신 소화 <ol><li> (50)의 비율을 1 M 우레아를 함유하는 25 mM의 중탄산 암모늄의 트립신 재구성 : 1 (W / W 단백질 : 트립신) 및 비켜 인큐베이션바람직하게는 써모 700 rpm에서 37 ° C에서 rnight. </li><li> 스핀 (10,000 XG, 15 분) 소화되지 않은 물질을 펠렛. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li></ol> 9. 포스 포 심화 <ol><li> 이전 18 설명 된대로 소화 트립신에서 정제 및 인산 화합물의 농축을 수행합니다. 350 ㎎ / ㎖의 2,5- dihydrobenzesulfonic 벤조산 (DHB), 80 % (V / V) ACN (아세토 니트릴), 2 % (v / v)의 TFA (트리 플루오 : 트립신 펩티드에게 DHB 완충액에서 10 배 희석 [DHB 버퍼 이루어져 산)] 및 티오 2 구슬 (200 μg의)를 건조에 적용됩니다. </li><li> 1 시간 동안 실온에서 회 전자에 둡니다. </li><li> , DHB 버퍼와 샘플을 씻으 스핀 뜨는을 제거합니다. 그런 다음 샘플을 세척 버퍼 [80 % ACN (v / v)의 2 % TFA (v / v)로] DHB를 제거하려면로 3 회 세척한다. </li><li> 최종 스핀 후 직접 2.5 % 수산화 암모늄 25 μL, pH가 10.5 ≥ 용액을 첨가하여 용출 완충제를 사용하여 포스 포 용출. 에스핀과 상층 액을 제거합니다. 즉시 ~ 0.3 μL 포름산으로 중화. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

정자의 성공 재현 단백질체 분석을위한 중요한 단계는 다음과 같습니다 출발 물질의 1) 순도; 원치 않는 염 및 세제의 2) 제거; 트립신은 단백질의 높은 수율을 소화 할 수 있도록하기 위하여 3) 그들의 전체 범위로 단백질을 변성 및 4) 펩티드의 손실을 줄이기 위해 처리 샘플을 최소화한다. 성공적 카우의 부고환 역류하기 위해서는, 정충 종료되는 사이의 영역을 찾는 것이 필수적이다. 랫트와 마우스 모두의 경우에, 이것은 부고환 꼬리 영역의 중앙에 (도 2A 참조), 오목 영역의 정점이다. 하나 정관 향해 더 오면 역세가 용이하고 성공 확률이 높다. 그러나, 이것은 정자 번호 손실 온다. 하나 이상의 코퍼스 근위 이동하려고 낸다면 압력의 양은 epididym 통해 다시 밀어 정자 필요알 덕트는 부고환에 손상이 필연적으로 발생, 종종 너무 높다. 부고환 역세 전통적 정자 22-25을 제거하기 위해 물을 포화 광유 매체로서 주사기 자체 평형 염 용액을 사용하여 수행된다. 두 절차는 LC-MS의 잠재적 문제가있다. 첫째, 미네랄은 그 어느 것도 절차에 이월되지 않도록주의해야한다 기본적으로 프로테옴 분석 및 관리에 전 세계적으로 사용되는 나노 C18 나노 열을 차단하는 것입니다. 이 경우, 그것은 계속 불가능하고 샘플을 본질적으로 손실된다. 이것은이 성공적이지만, 조만간 BWW 용액을 접촉한지 마자 정자 많은 운동성되어 있다고 인식하고, 꼬리 부고환 혼합 그러나 BWW 또는 주사기 다른 균형 염 용액의 사용에 의해 극복 될 수있다 세포. 이 문제를 회피하기 위해 우리는 단순히 공기와 정자를 백 플러시. 뿐만 아니라이다 QUAL액체 기반의 방법에 필적 정자의 성만하지만, 양이 동일하다. Phosphoproteomics 아마도 신호 전달 경로가 정자 포스트 사정에서 발생되는 확립 할 수있는 유일한 방법 중 하나입니다. 우리가 조사중인 주요 경로 중 하나는 capacitation하는 과정입니다. 이 난자에 결합 할 전에 정자는 &quot;capacitation&quot;을 거쳐야. 실제로, 이는 시간 동안 인큐베이션하여 정자 기본적으로 달성된다 (랫트에서 1.5 시간, 40 분 마우스 인간 3-24 시간) 혈청 알부민 용액 BWW. 이전에, 우리와 다른 capacitation에 관련된 여러 키나제의 역할을 보여 주었다. 관심, PKA의 삭제 II는 누구의 정자를 체외에서 자발적으로 수영 마우스를 생산하지만, hyperactivation (26)를받을 수 없습니다 μ. 후자는 정자가 낮은, 높은 속도, 낮은 진폭에서 자신의 수영 패턴을 변경함으로써, capacitation의 특징이다속도, 높은 진폭은 주파수를 이겼다. 우리는이 과정에 참여 다운 스트림 키나제가 pp60-CSRC (SRC)를 포함 보여 주었다 13,27 C-예 (28)와 C-ABL (14). 흥미롭게도, SRC의 억제는 capacitation에 의존하는 티로신 인산화 (13)를 중지합니다. 그러나, 이는 SRC 직접 티로신 인산화 (29)의 일반적인 발병에 관여하지 않고, 29 포스파타제 조절할 수 있음을 시사 okadaic 산으로 극복 될 수있다. 부고환에서 정자를 강제로 매체로 BWW 사용에 문제는 한 번 활성화, 마우스 정자 만 ...의 자격을 주다 약 40 분 소요됩니다. 정자의 분리가 5 분 / 마우스와 종종 여러 생쥐 실험에서 사용되는 걸릴 수 있음을 감안할 때, 다음 정자 실험의 시작 성숙의 다른 단계에있을 것입니다. 이것을 극복하기 위해, 공기 압력은 유리로 꼬리 정맥에서 부고환 정자 푸시 할 수있다. 뿐만 아니라 모든 정자 INACT 있습니다필자 그들이 꼬리 환경에서 발견되는 바와 본질적으로, 그것이 가능 운동성 및 운동성 phosphoproteomics과 비교한다. 두 개의 상이한 기능에 정자 상태를 비교할 때 phosphoproteomics 핸들링 샘플을 최소로 유지되어야한다. 단백질 침전 1)의 다른 전통적인 방법에 비해 메탄올의 클로로포름을 사용하는 2) 염 및 지방의 거의 모든 흔적을 제거하고 3) TCA (19) 위에 낮은 풍부한 단백질을 침전 입증 된 능력을 가지고, 추가적인 세척 단계에 대한 필요성을 감소시킨다. 트립신 소화하기 전에 단백질 침전 단백질 (트립신 에이즈 소화하는) 변성이 도움을 수행하지만 세포에 존재하는 MS와 호환되지 않는 대사 산물의 대부분을 제거뿐만 아니라 이후 좋습니다. 정자 포스 포의 비교는 다수의 방식으로 수행 될 수있다. 다른 것과의 기본 레벨, 하나의 샘플에서의 포스 포 식별 단순 비교에서&quot;스펙트럼 계수&quot;로 알려진 과정에서 샘플은 행해질 수있다. 초기 단백질체 연구는 낮은 복제물을 사용하고 있기 때문에 비판은 기본적으로이 방법에있다 (풀러 논의 Lundren 등. 30 참조). 더 정교한 접근은 펩티드 모 질량의 강도를보고, 다른 샘플 (라벨없는 비교 예)와이를 비교하는 것이다. 도 4에 도시 된 예에서, m / z 650-670에서 운동성에서 (도 4 위)로부터 존재하지만 운동성 존재 펩티드 (도 4 하단) 정자는 알 수있다. MS 기반의 라벨없는 정량화라고도이 프로세스는, 라벨없는 전략이다. 일반적 단백체 실행에 필요한 정량의 양을 감소시키기 위해 사용 들여서는 동위 원소를 사용하는 것이다. 동위 원소의 질량이 다르므로, 질량 분석기는 엘 루트의 세기를 비교하기 위해 사용될 수있다펩티드를 보내고. 그러나, 대부분의 다른 세포 유형과 달리, 일부 동위 원소 표지는 정자 적용 할 수 없다. 조직 배양에 사용될 수있는 예를 들면, 안정 동위 원소를 첨가 (버전이 다른 점화기에 첨가되는 동안 하나의 무거운 동위 원소, 하나의 샘플에 더해진다). 동위 원소가 혼입 된 단백질 얻을 때, 단백질 체학 분석은 두 샘플 (다중화)을 조합함으로써 수행 될 수있다. 그러나 정자의 경우, 이는, 1) 동위 원소 표지가 조직 배양에서 (~ 8)까지 여러 통로를 필요로하며, 2) 정자 세포가없고 따라서 핵 유전자 전사와 번역이없고, 단순히 사실 덕분에, 수행 할 수없는 어쨌든 그들은 모든 단백질에 동위 원소를 포함 할 수 없습니다. 이 주위에 한 가지 방법은 방사성 동위 원소를 마우스를 주문하는 것입니다, 그러나, 이러한 악명 비싸다. 대안적인 접근은 화학적 태그를 사용하는 것이다. 이 비 capacitated 마우스를 capacitated 마우스와 비교했을 때 수행되었습니다. 이 경우, D와 D 0에서 <sub&gt; 3 -label이 질량 분석기 (31)과 다른 하나의 샘플을 구별하기 위해 사용되었다. 다른 접근 방법은 라이신이 다른 질량 동위 원소와 화학적으로 표시되어있다 iTRAQ (상대 및 절대 정량 압법 태그)의 사용을 포함 할 수있다; 시스테인이 다른 질량 동위 원소 무거운 빛 물 라벨에 표시되어있다 스패 ​​터 주입 및 분사기 TMS-VI (동위 원소 코딩 선호도 태그). 각각의 모든 경우에, 그러나, 한가지 명심해야한다. MS는 샘플에 존재하는 것을보고, 이것은 그 시점에 그 샘플까지 일어난 모든 것을 반영한다. 각 단계에서의 수율을 최대화하는 동안 시료 처리를 최소화하는 것이 성공적인 프로테옴 분석을 위해 필요하다.

고환에서 등장하는 데, 정자는 매우 아직 현저하게 차별화된다,이 세포는 1, 2 미숙. 이와 같이, 이들은 3 개의 난자 헤엄 능력 인드 포함한 완전한 기능이 부족하다. 정자 세포의 성숙이 더 필요하지만 그들의 세포 분화 과정이 단계들은 유전자 전사와 상기 단백질 생합성 4 없게되어 있기 때문에, 이것은 표준적인 경로를 통해 이루어질 수 없다. 그들은 정소두고 부고환 5라고도 남성 생식 기관의 일부를 입력 생물학적 능력이 정자에게 부여된다. 부고환은 정관에 (고환) 원심성 덕트를 연결하고 모든 남성 포유 동물 6에 존재 단단히 코일, 차별화 된 관입니다. 정자는 점진적으로 CR은 끊임없이 변화하는 내강 환경에 의존, 부고환 하강하는 동안 그들의 시비 가능성을 취득로컬 부고환 상피 세포 7 어갈. 부고환 환경의 행동에 존재하는 다양한 분비 및 재 흡수 활동은 단백질, 탄수화물 및 지질 성분 (6)을 변경, 정자 자체를 수정합니다. 이러한 구성의 특히 초기 &#39;CAPUT&#39;영역 부고환의 중요성은, 외과 용 결찰 기법을 이용하여 8 예로 들었다. 원심성 덕트 결찰에 의해 고환 내에서 유지 정자는 완전히 난자 9-11을 비옥하게하기 위해 어떤 능력이 부족합니다. 부고환 환경에 더하여, 정자 워크 내 신호 전달 경로는 전기 - 병진 기존 정자 세포 보충을 수정한다. 예를 들어, 부고환 초기 영역에서 정자 이러한 후자의 영역 -5,12- 비해 단백질 인산화의 다른 패턴을 표시. C 광대 차이가 있기 때문에 이는 놀랍지 않다이 지역에서 정자의 apability. 예를 들어, 초기의, 부고환 CAPUT 정자는 immotilite이다. 대조적으로, 카우 영역으로부터 정자 앞으로 한번 등장 매질에 배치 프로그레시브 운동성을 받게 될 것이다. 부고환 정자 세포가 드 노보 단백질 생합성 능력이 있기 때문에, 정자의 기능을 조절하는 모든 고유 경로는 번역 후 변형 (PTM)를 통해해야합니다. 따라서, 그 단백질 체학을 당연한, 우리는 정자 세포 성숙을 이해하는 경우 특히 이러한 인산화 등 PTMS의 조사는 큰 추력을해야합니다. 다른 방법은 13 ~ 16 복고풍 백 플러싱 사용 epididymidies에서 정자를 얻을 수있다. 이 기술은 확실히 더 많은 시간이 소모되며 조작자의 지식을 가진 큰 정도 소요되지만, 정충 일관 99.99 % 이상의 순도를 입증 수득. 또한, 모든 다른 기술과는 달리, 정자의 CAN 가능 정자 운동성이 개시되는 방법 공부하게 정지 상태로 단리 할. 샘플 준비가 단백질체 분석에 가장 중요한 측면이므로, 정자의 분리 정자 프로테오믹스 연구의 가장 중요한 측면 중 하나가되고있다. 이 프로토콜은 카우의 부고환에서 분리하는 방법 정자에 대한 설명을 제공합니다. 이어서, 형성된 티오 포스 포이 농축 과정은 고도로 분화 된 세포로부터 정자 펩티드를 추출하는 방법에 대한 참조로, 개략되어있다. MS 접근법은 하나 하나의 상태에 꼬리 부고환 정자과 비교한다면 변화 포스 포를 구별하는데 사용될 수있다 (immotile 또는 비 capacitated) 정자 공부이에게 강력한 접근 방식을 (등 반응 운동성 capacitated, 첨체) 다른 기능.

<table><tbody><tr><td>2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone</td><td>Aldrich</td><td>195464</td><td></td></tr><tr><td>2-D 정량 키트</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청의 알부민</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>암모니아 용액 25%</td><td>Merck</td><td>1.05432</td><td></td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td>칼슘시그마</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 3-[3-(콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이</td>트 <td>연구 유기물</td><td>1300C</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>BDH</td><td>10077.6B</td><td></td></tr><tr><td>인산수소이나트륨</td><td>머크</td><td>1.06580</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>시그마</td><td>O6440</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine-L</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (free acid)</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetic acid free acid</td><td>Sigma</td><td>I4386</td><td></td></tr><tr><td>Lactic</td><td>acid Sigma</td><td>L1750</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Res. Org.</td><td>0090M</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Merck</td><td>10158.6B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (sterile)</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>GEHE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>포스파타제 억제제 칵테일 정지</td><td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td><td>PIE78420</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td></td><td>Sigma P9333</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소칼</td>륨 <td>Medical Store</td><td>CH 600</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>인산 이수소</td><td>나트륨 Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>탄산 수소</td><td>나트륨 BDH</td><td>10247.4V</td><td></td></tr><tr><td>피루브 산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>트리스, 초순수 등급</td><td>Amresco (Astral)</td><td>AM0497</td><td></td></tr><tr><td>트립신 골드, 질량 분광 등급</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>시그마</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>염화 아연</td> 시<td>그마</td><td>Z0173</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mm 폴리에틸렌 튜브</td><td>굿펠로우</td><td>ET317100</td><td></td></tr><tr><td>30G 바늘</td><td>테루 모</td><td>NN2038R</td><td></td></tr><tr><td>3ml 주사기</td><td>테루 모</td><td>SS035</td><td></td></tr><tr><td>4.2 mm 폴리에틸렌 튜빙</td><td>굿펠로우</td><td>ET317640</td><td></td></tr><tr><td>꼰 실크 (5-0)</td><td>Dynek</td><td>CSS0100</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>시그마</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 비드 (분해된 컬럼에서)</td><td>Titansphere</td><td>6HT68003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>C7B30</td><td>시그마</td><td>C0856</td><td></td></tr></tbody></table>

설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

정자는 세포 유형의 사이에 매우 독특합니다. 고환에서 생산하지만 사전 커서 라운드 셀 연장과 형태 학적으로 정자로 인식되고 무엇으로 분화하기 시작하면, 모두 핵 유전자 전사 및 번역이 꺼져 있습니다. 그러나, 정자 운동성 또는 계란에 대한 인식 능력을 갖지 않는, 매우 미성숙하다. 이들 이벤트 모두 정자 통과되면 부고환으로 알려진 보조 기관을 발생한다. 정자 세포 부고환 통과 걸리는 ~ 십이일 통로 중에 존재하는 단백질의 번역 후 변형은 세포의 성숙에 중추적 역할을한다. 그러한 하나의 중요한면은 단백질 인산화이다. 정자 성숙 중에 일어나는 인산화를 특성화하기 위하여, 순수한 정자 세포 집단 및 포스 포 사전 분획 모두 확립되어야한다. 순수한 오 정자의 분리를 위해, 방법을 플러싱 기술을 다시 사용말단 또는 꼬리 epididymides에서 F 높은 품질과 수율이 설명되어 있습니다. 가용화, 소화 및 이산화 티탄 친 화성 크로마토 그래피를 통해 정자 포스 포의 사전 분류하는 단계는 설명한다. 격리되면, 유기 인산 화합물은 정자 성숙 과정에서 일어나는 인산화 수준을 특정 아미노산 잔기에 모두 단백질 인산화를 식별하고 정량화하기 위해 MS에 주입 될 수있다.

어떤 단백질체 분석 결과의 품질은 출발 물질에 의존하고있다. 현대 MS로, 샘플 준비에 약간의 오염은 쉽게 선택됩니다. 따라서, 고순도의 정자를 제공하는 방법을 선택하는, 정자 세포 프로테오믹스의 경우, 중요하다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 역행 역세는 카우의 부고환에서 정자를 검색하는 데 사용된다. 이것은 하나 천천히 부착 된 주사기에서 공기 압력을 적용 할 수 있습니다 PE 튜브와 정관을 cannulating 포함한다. 그림 1a는 정관과 함께 카우의 부고환을 보여줍니다. 그림 1B는 정관이 연결되는 방식의 근접 촬영입니다 캐 뉼러를 삽입됩니다. 이 과정에서, 그래서 정자는 꼬리 epididymides에서 한 세관의 절제 끝에서 방출된다. 도 2a에 도시 된 바와 같이,이 정자 caud의 정점 영역에서 추출부고환과는 정지 상태 (그림 2B)에 유리 모세관에 빨려된다. 이 이전과 운동의 활성화 후 정자의 phoshoproteomic 분석을 수행 할 수있는 능력이다 조금도있는 전통적인 &quot;수영 - 업&quot;방법에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 정자는 다음 중 하나의 선택의 매체로 추방 될 수있다. 그림 2C (왼쪽)은 정자가 BWW 미디어로 추방 후 즉시보고하는 방법을 보여줍니다. 세포의 대부분은 뭉쳐있다. 그들이 용액 (도 2C, 우측 셀) 내로 균일 밖으로 수영 때문에, 세포의 10 분 후 능력이 증명된다. 백 플러싱 기술은 정자 세포에 거의 영향을 가지고 있기 때문에, 우리는 가까운 100 % 운동을 획득하고 세포가 외부 자극없이 미디어로 빠르게 분산. 일반적인 백 플러싱 실험에서 정자는 스위스 - 마우스가 포함되어에서 복구6 10 × 1-5 사이의 세포. 이것은 동물의 나이에 크게 의존와 마우스의 다른 균주에 따라 다를 수 있습니다. 노르웨이 쥐, 우리는 일반적으로 200 × 106 정자를 얻을, ± 20 %. 그림 2D는 쥐 카우의 부고환에서 얻은 정자의 순도를 나타냅니다. 샘플 자체 외에, 샘플 제조에 관한 주요한 문제점 중 하나는 트립신 소화 수율이다. 단백질 침전뿐만 아니라 단백질의 변성,뿐만 아니라 MS와 호환되지 않는 둘 불필요한 세제 염을 제거에 중요한 역할을한다. 우리는 최선을 작업 할 수있는 메탄올 - 클로로포름 침전을 발견했다. 뿐만 아니라,이 절차는 TCA 침전 (19) 등 다른 것보다 더 낮은 풍부한 단백질을 침전보고되어 있지만, 부가적인 장점을 가지고있다. TCA 침전 후, 꽤 남아있을 수 TCA 펠릿 정지 후 pH를 다시​​ 조정하는 것이 필요하다산성. TCA 침전의 펠렛 아세트산을 제거 높은 유기 용액으로 세정 될 수 있지만, 이는 처리 및 결과 irreproducibility 견본을 추가한다. 산을 중화 않으면 가난한 트립신 펩티드 수율 발생합니다. 메탄올 - 클로로포름 침전뿐만 아니라 퀵하지만 샘플을 산성화하지 않을 것이다. (3)은 일반적으로 상부 및 하부 사이의 상간 100 μg의 샘플에서 본 단백질 펠렛을 도시한다. 인산 화합물의 분리는 다수의 방식으로 발생할 수있다; 그러나 재현성이 샘플이이 단계를 포함까지 취급 된 방법에 따라 달라집니다. 일반적인 개발 방법 중 하나는 티오 2, 원래 마틴 라센 18,20,21의 그룹에 의해 개발했다. 마이크로 컬럼에 사용하기위한 프로세스로서 설명했지만, 우리는 일괄 크로마토 그래피를 이용하여 재생 가능한 데이터를 획득 할 수있다. 프로세스의 성공은 용출 버퍼에 크게 의존, 미친있는이어야합니다<html> 올바른 구성과 전자; 그렇지 않으면 인산 화합물이 전혀 용출되지 않습니다. 이산화 티탄의 프로토콜과 대표 데이터의 재현성이 아닌 운동성 (그림 4 위)과 m에서 운동성 (그림 4 하단) 상태에서 카우의 부고환 정자에서 포스 포 농축 / Z 650-670 볼 수 있습니다. 우리는이 생물 복제합니다 (17)를 사용하여도 매우 재현 기술이 있음을 증명하고있다. 시간이 지남에 따라 나타나는 청색 줄무늬 아세토 니트릴의 농도가 증가로서 C18 나노 컬럼으로부터 용출 된 펩타이드이다. 분명히, 운동성 인구 (N = 3, N = 8 도시 전형적 실행), 비 - 운동성 범위에 완전히 존재하지 않는 다 651.5 범위 주위 모노 이소 ​​토픽 질량, 펩티드 클러스터있다. 탠덤 질량 분석은 다음이 펩티드를 식별하는 데 사용된다. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 카우의 부고환의 카우의 부고환의 캐 뉼러 (A) 그림. 정맥 자체는 미리 뽑아 끝 부분의 약 1-2cm를 노출 아래로 녹화됩니다. 이는 미세 # 1 5watchmakers 집게를 사용 정관에 삽입된다. (B) 캐 뉼러 정관과 캐 뉼러를 모두 포함 세그먼트 주위에 잘 실크 매로 고정된다. 마우스에서 꼬리 부고환 세포 및 유체의 약 2-3 μL를 1 × 106 / μL의 농도로 수집된다. 쥐 (도시)에서 유체의 약 30 ~ 40 μl의 비슷한 농도를 얻을 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> 그림 2 : 유능한 부고환 정자를 수집하는 데 사용되는 유리 모세관. (A) 카우 전자의 정점에서 하나의 가느 다란 관<html> pididymis 격리 및 깨진 것입니다. 이 도시되어 발생되는 대략적인 위치. (B) 이미지의 상단에는 빈 유리 모세관 튜브를 표시하고 아래는 이전에 백 플러싱 쥐에서 하나 보여줍니다. 더 혈액 오염을 최소화 상피 세포 오염이 없습니다. (C) 정자가 여전히 부고환 액에 희석하지 않았을 아르, 그들은 활성화하기 시작하지 않았습니다. 정자가 처음 BWW 솔루션으로 추방 될 때, 컴팩트 &quot;문자열&quot;(왼쪽)으로 나와. 10 분 후에 정자의 대부분은 어떠한 외란 (오른쪽)없이 용액에 수영 때문에 셀의 능력을 용이하게 확립된다. (D)들이 수영 왼쪽왔다 직후 꼬리 부고환 세포의 분취 량 포토 아웃 세포의 순도를 보여준다. g3highres.jpg &quot;/&gt; 그림 3 :. 메탄올 - 클로로포름 침전되면 정자 용해왔다, 가용성 분획 메탄올 - 클로로포름은 단백질과 오염 물질의 제거의 변성을 보장하기 위해 침전이다. 단백질 펠렛은 메탄올 / 물과 클로로포름 단계 사이의 인터페이스에 나타납니다. 이 펠렛을 방해하지 않도록 조심스럽게 상층을 제거한다. 그것은 어떤 단백질이 손실되지 않도록 상위 단계의 2 ~ 3 mm로 떠날 것이 일반적이다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> 그림 4 :. 일반적인 이산화 티탄 풍성 포스 포 프로필 설명 프로토콜을 사용하여, 꼬리 부고환 정자는 (상위 N = 3) immotile 하나에서 분리되었다 또는 운동성이있는 상태 (아래, N = 3). ~ 651.5 D의 단일 동위 원소 질량 펩타이드 클러스터이 immotile 것 (화살표)에서 운동성이 인구에 존재하지만 완전히없는 것으로 표시됩니다. 이러한 특성의 비교는 &quot;이 라벨없는 (MS는 기반)&quot;라고 칭한다. 펩티드 질량 및 체류 시간은 다음 펩티드로부터 유래 된 단백질을 탠덤 질량 분석 용 화합물을 대상으로 식별하는 데 사용된다.

모든 세포 유형에 대한 단백질체 분석은 액체 크로마토그래피 질량 분석법(MS) 전에 시료의 복잡성을 줄이기 위해 출발 물질의 순도와 사전 분획에 크게 의존합니다. 역 세척 기술을 사용하면 설치류에서 순수한 정자를 얻을 수 있습니다. 분해 후 인산펩티드는 TiO2를 사용하여 농축할 수 있습니다.

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

다음 실험의 전반적인 목표는 정자 세포 성숙 과정 중 정자 내에서 발생하는 인산화 펩타이드의 변화를 정량화하는 것입니다. 이를 위해 마우스에서 미성숙 부고환(coddle epididymus)을 제거하고, 정자 세포의 역행성 세척(retrograde back flushing)을 수행하여 세포를 마이크로 모세관 튜브에 수집합니다. 다음으로 정자 세포가 평형 염 용액(balanced salt solution)으로 헤엄쳐 나오게 하여 오염 단백질을 제거한 후, 오염된 염과 지방을 제거하기 위해 세척, 용해 및 침전 과정을 거칩니다.인후 단백질을 trypsin으로 소화시킨 후, 인산화 펩타이드를 농축하기 위해 이산화티타늄을 사용하여 농축합니다. 결과는 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법 분석을 바탕으로 단백질의 인산화 상태의 정량적 변화를 보여줍니다. 이 방법은 정자가 EPIs를 통과하거나 수정 능력을 획득하는 동안 발생하는 인산화 단백질체의 변화는 무엇인가와 같은 생식 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 정자 세포 생물학에 대한 통찰력을 제공했을 뿐만 아니라, 모델 생물체, 암과 같은 질환 연구, 신경계 병리 및 일반적인 신호 전달 경로에도 적용될 수 있습니다. EPIs가 조작될 부위의 해부학적 구조를 파악하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 캐뉼라 제작을 위해 1리터의 Milli Q water에 다음 성분들을 첨가하여 200밀리리터의 Biggers, Whitten and Whitten 또는 BWW 작업용 줄기 용액을 만드는 것으로 시작하십시오.내경 0.4 mm, 외경 1.1 mm의 폴리에틸렌 튜브를 사용합니다. 튜브가 녹기 시작할 때까지 낮은 열로 가열합니다. 즉시 튜브의 양 끝을 바깥쪽으로 당겨 늘려 외경을 감소시킵니다.튜브의 한쪽 끝을 좁게 잘라 S deens의 캐뉼라 삽입이 용이하도록 합니다. 반대쪽 끝은 약 15 centimeters 길이로 자릅니다. 그 다음 뭉툭한 끝부분에 30 gauge 바늘을 삽입하고, 완전히 밀어 넣은 3 milliliter 주사기를 연결합니다.20 centimeter 길이의 PE 튜빙을 잘라 흡입 마우스피스를 만들고 이를 캐뉼라의 한쪽 끝에 삽입합니다. 마이크로 모세관 유리관 홀더와 유리 마이크로 모세관을 삽입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시킨 후, 음낭에 작은 절개를 내어 부고환(epi)을 노출시킵니다.그 다음, 5번 시계 제작용 핀셋을 사용하여 고환과 부고환을 강 내에서 끌어냅니다. 부고환 미부(cauda epididymis)로부터 정관의 약 1~2cm만 남기고 나머지는 절단하여 제거합니다.그런 다음 해부 현미경을 사용하여 5배에서 40배 배율 사이로 관찰하며 근위 EENT 관과 부고환을 정소에 연결하는 조직을 절단하여 제거하고, 수컷 생식관 전체를 제거합니다. 좁아진 캐뉼라 끝부분의 1~2cm를 시야 내에 두고 5번 시계 제작용 포셉을 이용해 테이프로 고정합니다. 정관의 양측을 조심스럽게 잡고 캐뉼라의 노출된 부분 위로 끌어당깁니다.그런 다음 비흡수성 흑색 꼬임 처리된 실크를 사용하여 시계 제작용 5번 포셉으로 캐뉼라를 삽입한 조직 주변에 매듭을 단단히 묶습니다. catheter의 원위부 끝을 잡고 tunica externa를 제거합니다.단일 표피 세관을 노출시키기 위해 세관을 조심스럽게 드러내고, 정자가 방출될 수 있도록 틈을 만들어 분리합니다. 다음으로, 주사기의 플런저를 천천히 눌러 정관 속으로 공기를 주입합니다. 이때 발생하는 압력으로 인해 파손된 세관을 통해 정자가 배출됩니다.그런 다음 마우스피스에 흡입력을 가해 정자를 유리 모세관 안으로 끌어당깁니다. 마우스피스로 가볍게 불거나 시린지를 연결하여 유리 모세관 내의 정자를 1 mL의 pre-war B WW 용액으로 배출합니다. 그리고 이 용액을 사용하여 세포를 3회 세척함으로써 오염된 단백질을 제거합니다.마지막 세척액을 제거한 후, 정자를 나중에 사용하기 위해 동결시키거나 4% chaps, 2 M thio urea, 50 mM tris pH 7.4를 사용하여 단백질을 가용화하고 간헐적으로 볼텍싱하며 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 10,000 ×g에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 새 튜브로 옮긴 후, 단백질 용액에 최종 농도가 10 mM이 되도록 DTT를 첨가하여 이황화 결합을 환원시키고 단백질을 알킬화합니다. 볼텍싱 후 실온에서 30분 동안 배양합니다.그 다음 라이세이트에 50 millimolar의 IO acetamide를 넣고 볼텍싱한 후, 암소 상태의 실온에서 30분 동안 배양합니다. 단백질을 침전시키기 위해 라이세이트 1부피, 메탄올 1부피, 그리고 클로로포름 0.5부피를 혼합합니다. 샘플을 볼텍싱한 후 10,000 Gs에서 2분 동안 원심 분리하고, 계면이 흡입되는 것을 방지하기 위해 약 2 mm를 남기고 상층액을 수집합니다.메탄올 1부피를 추가한 후, 튜브를 가볍게 뒤집어 다시 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 3~4분 동안 공기 건조하여 트립신 소화 및 인산화 펩타이드 농축을 수행합니다. 1 M urea가 포함된 25 mM 중탄산암모늄을 사용하여 시작하십시오.트립신을 재구성하려면, 단백질과 트립신의 중량비가 50:1이 되도록 F 50을 혼합하고 37°C, 700 RPM의 Thermo Mixer에서 밤새 배양합니다. 원심분리를 통해 소화되지 않은 물질을 펠렛으로 가라앉힌 후, 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 준비한 DHB 완충액을 사용하여 트립신 소화된 펩타이드를 10배 희석하고, 이를 200 µg의 건조된 이산화티타늄 비드에 처리하여 회전 혼합기에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, DHB 완충액으로 샘플을 한 번 더 세척한 다음, 80% ACN과 2% TFA로 구성된 세척 완충액을 사용하여 샘플을 3회 세척합니다. 최종 원심분리 후, 2.5% 수산화암모늄을 첨가하여 인산화 펩타이드를 용출시키고, 즉시 원심분리하여 상층액을 수집합니다.여기서 보는 것처럼 0.3 µL의 formic acid를 사용하여 시료를 산성화합니다. 이 프로토콜의 한 가지 장점은 정자가 분리된다는 것입니다. 정지 상태에서는 B WW 배지로 배출된 직후 많은 세포가 엉키게 됩니다.하지만 10분 후, 이들은 형태가 일정해지며 용액은 균질해집니다. 이 비디오에서 설명한 준비 과정으로는 통상적으로 200 × 10⁶마리의 정자를 얻을 수 있습니다. 이 수치는 AR 쥐의 수 정관 말단(cauda epididymis)에서 추출한 정자의 순도를 보여줍니다.시료 준비와 관련한 주요 문제 중 하나는 트립신 처리 및 소화 과정에서의 회수율입니다. 시료의 pH 조절이 필요한 경우가 많은 TCA 침전법과 달리, 페놀 클로로포름 침전법은 신속하며 시료를 산성화하지 않습니다. 여기에 제시된 것은 하단 및 상단 계면 사이에서 일반적으로 관찰되는 100 $\mu\text{g}$ 시료의 단백질 펠렛입니다. 다음은 이 프로토콜의 재현성 결과입니다.시간이 지남에 따라 나타나는 파란색 줄무늬는 C 18 나노 컬럼에서 용출되는 펩타이드입니다. 모달 모집단에서 아세토니트릴 농도가 증가함에 따라, 비범위 영역에서는 완전히 부재하는 약 651.5 Daltons의 펩타이드 클러스터가 존재합니다. 인산화 펩타이드 농축 프로토콜은 효율적인 기술입니다.이 절차를 수행할 때, 프로테오믹스에서 재현성 있는 결과를 얻기 위해 시료 준비가 핵심적인 요소라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 방법은 당단백질을 분리하는 데 맞게 조정될 수 있으며, 이를 통해 프로테옴의 시알산 함량에 변화가 일어나는 단백질이 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 펩타이드 혼합물에서 포스호펩타이드의 항체 기반 면역침전을 보여줍니다. 농축된 인산펩타이드는 진공 농축되어 다운스트림 분석을 위해 보관됩니다.

인산펩타이드 농축: 복합 펩타이드 혼합물에서 특정 인산화 펩타이드를 분리하는 항체 기반 면역침전 기법

이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

이 프로토콜에는 전립선 암 세포 선 또는 단백질 질량 분석 기반 을 통해 phosphoproteome의 분석에 대 한 조직에서 phosphopeptides을 풍부 하 게 추출 하는 절차를 설명 합니다.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

여기, 우리 보고 dynamin 파라핀 끼워 넣어진 마우스 epididymal 섹션에 있는 단백질의 검출 및 불멸 하 게 epididymal 셀 라인 (mECap18)의 프로토콜을 설명 하기 위해의 면역 형광 지역화 합니다. 우리는 또한 epididymal 액체 및 조건된 셀 미디어에서 분 비 단백질의 격리에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

우리는 마우스 정자 capacitation 도중 당해 및 산화 인산화에 있는 실시간 변경을 감시하기 위하여 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

이 프로토콜은 이온 채널 활동을 직접 기록하는 것을 목표로 전체 세포 구성에서 포유류 정자 세포의 전기 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 정자 이온 채널의 전기 생리학적 프로파일을 설명하는 데 중요한 역할을 했으며 분자 정체성과 조절을 밝히는 데 도움이 되었습니다.

포유류 정자 세포의 원형질막을 가로지르는 전기 전류 기록

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

상기 프로토콜은 해부된 마우스 배아 안면 과정 또는 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 단리하고 인산화된 단백질 수준을 평가하기 위해 후속 웨스턴 블롯팅을 수행하는 방법을 제시한다.

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

본 프로토콜은 기능성 자성 비드를 이용한 요로 세포외 소포체의 효율적인 분리를 위한 상세한 설명을 제공한다. 또한 웨스턴 블로팅(western blotting), 단백질체학(proteomics) 및 포스포프로테오믹스(phosphoproteomics)를 포함한 후속 분석도 포함됩니다.

단백질체학 및 인산염체학 분석을 위한 생체 유체에서 세포외 소포체의 화학적 친화성 기반 분리

여기서는 쥐의 초기 구간(간질성 주사)과 꼬리부고(혈관 내 주사)에서 염증 자극을 유도하는 두 가지 뚜렷한 외과적 주사 모델을 설명한다. 이 방법들은 부고고의 다양한 부위에서 특정 부위 반응을 연구할 수 있게 합니다.

병원체 관련 분자 패턴에 의해 유발된 부고고환염의 마우스 모델

배우세요 설치류 부고환 정자의 포스포 펩타이드 정량 분석 방법을 통해 생식 생물학 연구를 수행하는 기술입니다. 이 방법은 정자 성숙 과정에서 단백질 인산화 변화를 정량화하여 생식 메커니즘 이해에 기여합니다.

설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

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