4.11: In ovo 닭 배아의 전기 천공

전기천공법(Electroporation)은 세포에 외부 유전 물질을 도입하는 데 사용되는 기술입니다. 난자 내부의 병아리 배아의 전기천공법 또는 난자 전기천공법은 유전 물질의 전달이 특정 조직과 특정 발달 시점에 국한될 수 있기 때문에 발달 생물학자에게 유용한 도구입니다. 이 비디오는 in ovo electroporation의 기본 원리를 소개하고, 절차의 필수 단계를 설명하고, 이 기술을 사용하여 개발 중 생물학적 과정을 연구하는 방법에 대해 설명합니다.

우선, DNA를 세포에 넣는 데 어떻게 사용할 수 있는지 파악하기 위해 electroporation의 기본 원리를 검토합시다.

첫째, 미세주입(microinjection)을 사용하여 관심 세포에 가까운 DNA를 전달합니다. 그러나 DNA는 원형질막을 뚫고 세포 안으로 들어갈 수 없다.

이 문제를 해결하기 위해 전류가 가해져 멤브레인의 안정성을 방해하여 기공을 만듭니다. 이 전기장의 두 번째 결과는 음전하를 띤 DNA가 양극으로 이동하는 것입니다. 그 결과, 양극에 더 가까운 주입 부위 쪽의 세포만 DNA로 형질 주입됩니다.

이제 기본 원리를 알았으니 전기천공을 위해 배아를 준비하는 방법에 대해 이야기해 보겠습니다. 햄버거 해밀턴 스테이지 20보다 오래된 배아를 사용해야 하는 경우, 조직 접근을 개선하기 위해 껍질 밖 또는 난소 밖에서 병아리를 배양하는 것이 가장 좋습니다. 이 비디오는 껍질 내에서 또는 난소에서 발달하는 초기 배아에서 수행되는 전기천공법에 초점을 맞출 것입니다.

우선, 알은 37 ? 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 C. 알이 부화하는 동안 주입 및 전기천공을 위한 도구를 준비합니다. 먼저 피펫 풀러로 0.5mm 유리 피펫을 당겨 모세관 바늘을 만듭니다. 피펫을 열려면 현미경 아래에 놓고 팁의 작은 조각을 떼어냅니다. 그런 다음 주입된 용액을 시각화하는 데 도움이 되는 염료뿐만 아니라 구조체의 적절한 희석액을 포함해야 하는 주입 용액을 준비합니다.

바늘 내에서 유체의 움직임을 제어하려면 바늘을 사람의 동력으로 작동하는 입 피펫에 부착하십시오. 또는 바늘을 미세 주입기에 로드하여 공기의 압력 펄스를 조정할 수 있습니다. 팁을 주입 용액에 담그고 음압을 가하여 바늘을 채웁니다.

바늘 외에도 전극이 필요합니다. 이들은 어댑터에 의해 함께 고정된 두 개의 노출된 전선으로 구성됩니다. 한 쌍의 케이블은 전극을 전기 펄스 발생기 또는 전기천공기에 연결하여 펄스 지속 시간, 주파수 및 전압을 제어합니다. 핸즈프리 작동을 위해 electroporator는 풋 페달로 활성화할 수 있습니다.

난자가 준비되면 껍질의 창을 자르고 배아가 마르는 것을 방지하기 위해 행크스와 같은 생리학적 소금 용액을 몇 방울 떨어뜨립니다. 현미경으로 관심 조직이 바늘에 접근할 수 있도록 난자를 배치합니다. 그런 다음 모세관 바늘로 배아를 뚫고 부드러운 압력을 가하여 용액을 전달합니다.

이제 구조물을 주입했으므로 전기천공법을 수행할 차례입니다. 전극이 Hank의 용액에 잠기고 관심 조직이 그 사이에 중앙에 오도록 전극을 배치합니다. 전류를 인가하려면 풋 페달을 밟고 전극 주위에 거품이 형성되는지 확인하십시오.

전기천공이 완료되면 배아에서 전극을 제거하고 70% 에탄올로 닦아냅니다. 감염을 예방하기 위해 항생제를 첨가한 소금 용액 몇 방울을 넣고 테이프로 창을 막습니다. 마지막으로, 표현형 분석 전에 지속적인 발달을 위해 난자를 인큐베이터에 다시 넣습니다.

이제 우리는 ovo electroporation에 대해 모두 배웠으므로 과학자들이 개발 연구에서이 기술을 어떻게 적용하고 있는지에 대한 몇 가지 예를 살펴 보겠습니다.

우선, electroporation은 knockdown 구조체의 전달에 의한 유전자 발현을 차단하는 데 사용할 수 있습니다. 이 예에서, 발달 중인 신경관의 세포는 유전자 침묵 구조체로 전기천공되었습니다. 배아가 발달하도록 한 다음 정상 샘플과 녹다운 샘플 간에 축삭 궤적을 비교하여 축삭 유도의 유전적 제어를 평가했습니다.

반대로, in ovo electroporation은 단백질 인코딩 유전자와 프로모터(RNA 중합효소와 결합하여 전사를 시작하는 서열)를 포함하는 플라스미드를 도입하여 세포의 하위 집합에서 단백질을 발현하는 데에도 사용할 수 있습니다. 여기서 과학자들은 배아 뇌의 세포에 단일 유전자를 전달했다. 이 유전자의 단백질 산물과 특정 신경 아형의 마커를 모두 검출하기 위한 조직 염색은 전기천공된 유전자가 신경 발달을 변화시킨다는 것을 보여줍니다.

형광 단백질을 암호화하는 DNA 구조체는 발달 중에 세포와 구조를 시각화하기 위해 전기천공법으로 도입될 수도 있습니다. 이를 통해 척수 발달과 같은 복잡한 과정을 실시간으로 이미징할 수 있어 시간 경과에 따른 세포 움직임의 역학에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

당신은 방금 유전 물질을 병아리에 전달하는 유용한 기술인 in ovo electroporation에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이 비디오는 전기천공법의 기본 원리, 병아리를 주입하고 전기천공하는 데 필요한 단계, 현재 개발 연구에서 이 기술의 적용에 대해 논의했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!