Name: 에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 배우세요 마우스 태아 소장 전체 장기 배양 시스템을 이용하여 신호 전달 경로를 조절하고 융모 발달의 3차원 라이브 영상을 분석하는 방법을. 이 기술은 장기 발생 과정에서 세포 과정을 실시간으로 관찰할 수 있게 합니다.

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우리는 지도교수인 Deborah L. Gumucio 박사와 문화와 이미징 방법을 정의하는 데 귀중한 지원을 해주신 것에 감사드립니다. 또한 전체 장 장기 배양 시스템의 발전에 기여한 Jim Brodie 박사, Hong-Xiang Lu 박사, Charlotte Mistretta 박사 및 Ann Grosse 박사에게 감사드립니다. 이미징에 대한 유용한 토론은 Chip Montrose 박사, Michael Czerwinski 및 Sasha Meshinchi로부터 훌륭한 조언을 받았습니다. 모든 이미징은 University of Michigan의 현미경 및 이미지 분석 실험실에서 수행되었습니다. 자금 지원은 NIH R01 DK065850에서 제공했습니다.

참고 : 모든 쥐가 실험 동물 의학 미시간 의과 대학 단위의 대학의 승인을 동물의 사용 및 관리에 대학위원회의 지침에 따라 프로토콜을 사용하여 인도적으로 처리 하였다. 1 전체 장기 문화 시스템 <ol><li> 미디어 및 문화 판의 제조 <ol><li> 조직 배양 후드에서 스톡 병 BGJb 매체 5 mL를 제거하고, 펜 / 스트렙토 5 mL를 추가한다. 5 밀리그램 / (PEN / 스트렙토)와 BGJb 매체의 49 ml의 아스코르브 산 1 ㎖를 첨가하여, 50 ㎖의 원뿔형 튜브에 미디어 콘텐츠의 작업을 준비한다. </li><li> 트랜스 웰 아래의 각각 1 ㎖에 첨가하여 6 웰 배양 플레이트를 준비한다. 참고 : 모든 6 트랜스 웰을 사용하지 않을 경우, 나중에 사용하기 위해 신선한 무균 6 웰 플레이트에 추가 트랜스 웰을 이동합니다. 세 10cm 무균 배양 접시에 각각 BGJb 미디어를 작업의 3 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 해부를위한 준비 <ol><li> 70 % etha에서 해부 도구를 적시와 NOL 작업하는 동안 청소 도구를 보관하십시오. </li><li> 큰 얼음 양동이 해부 영역을 설정하고 6 웰 배양 판과 얼음에 BGJb 미디어와 10cm 배양 접시를 놓습니다. 해부와 문화에 대한 장을 준비하는 동안 가능한 한 많은 얼음에 작업 할 수 있습니다. </li><li> 태아 창자 수확 용 자궁 전위에 의해 이소 플루오 란 (100 μL) 이전 euthanization에 함께 실에서 성인 여성 생쥐를 마취. </li><li> 자신의 어머니로부터 태아를 수확 한 후, 각각의 태아가 신중하게 차트 13을 준비 Theiler에 따라 무대. 정기적으로 하나의 쓰레기 내에서 관찰되는 발달 단계에서 최대 24 시간의 변화에​​ 각 태아의 나이를 결정하는 포스트 성교 일에 의존하지 마십시오. </li></ol></li><li> 태아 내장의 해부 <ol><li> 창자를 제거하기 전에 잘린 태아를 안락사. </li><li> 괞 찮아 후 1 배 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 각 장을 해부BGJb 미디어 작업과 10cm 페트리 접시로 CE. </li><li> 조심스럽게 배에서 비장과 위장과 상부 십이지장에서 췌장을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 소장은 곧게 할 수 있도록 가능한 한만큼의 연결을 분리 한 많이 붙어있는 대망을 떠나 돌보는 대망 구분합니다. 참고 : 부드럽게 내강 내용이 소장을 통과하고 절단 끝에서 추방 할 수 있도록 세 동일한 세그먼트로 장을 분리 장 E14.5보다 나이 또는 사람들은 더 이상 24 시간 이상 배양하고 들어. 그러나, 배양을 위해 E13.5에 앞서, 장막 제대로 소장의 길이에 걸쳐 확장 할 수 있도록 부위의 3 세그먼트를 분리하기 전에 배양 한 후 24 시간까지 기다린 시작했다. </li><li> 문화 판 (1.1.2)의 트랜스 웰에 장 조각을 전송하기 위해 입 피펫을 사용합니다. </li><li> 그들은 transwel에 걸쳐 직선이되도록 필요에 따라 조심스럽게 내장의 위치를리터. 주 : 창자가 튜브를 통해 내강 내용을 이동 시작하면 장에있는 꼬임 장에 백업 및 손상의 원인이됩니다. </li></ol></li><li> 문화 및 치료 <ol><li> , 트랜스 웰 아래에서 용지를 제거 트랜스 웰에서 (추가 재조합 단백질이나 약물 억제제와 미디어 작업) 치료 미디어 700 μl를 추가합니다. </li><li> 내장의 상단에 치료 미디어 적가의 300 μl를 추가하고 트랜스 웰을 흡수 할 수 있습니다. 필요에 따라 내장 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 치료 시약의 반감기에 따라 적어도 하루에 한 번 또는 더 자주 치료 미디어를 변경합니다. </li></ol></li><li> 치료 시약의 지역화 된 소스 단백질 젖 아가 로스 비드의 제조 <ol><li> 스토리지 컨테이너에 아가로 오스 비즈를 재현 탁하고, 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 아가 로스 비드의 100 μl를 전송합니다. </li><li> 멸균 1X pH가 튜브의 남은 볼륨을 채우기osphate 완충 식염수 (PBS)와 그들을 씻어 구슬을 섞는다. 몇 분 구슬이 바닥에 정착 한 후 구슬의 상단에에서 PBS를 피펫 할 수 있도록하는 랙에 미세 원심 분리 튜브를 놓습니다. 멸균 1X PBS와 미세 원심 분리 튜브를 채우고 두 번 더 세척 과정을 반복합니다. </li><li> 두 번 치료를 원하는 농도로 관심의 단백질을 준비합니다. </li><li> 배 단백질 주식의 5 μL로 세척 아가로 오스 비드 5 μl를 혼합하고 부드럽게 단백질 구슬을 선동. 부드럽게 매 10 ~ 15 분을 혼합, 1 시간 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. </li><li> 장내에 구슬을 배치하기 전에 멸균 1X PBS에 잠시 구슬을 씻어. </li></ol></li><li> 아가로 오스 구슬의 배치 <ol><li> 부드럽게 당겨 모세관 바늘 입 피펫을 사용하여 내장의 상단에있는 아가로 오스 비드를 배치합니다. 거친 취급 장에 손상을 부상당한 지역에 융모 발달을 차단하므로 매우주의 구슬을 놓습니다. </li><li> 창자의 연동 운동과 배양 시간이 지남에 따라 내장의 롤 오프한다 배치 된 구슬의 절반 정도를 받아야하기 때문에 분석에 필요한 두 배나 많은 구슬을 놓습니다. </li></ol></li><li> 배양 내장의 고정 <ol><li> 조심스럽게 트랜스 웰 아래에서 치료 용지를 제거하고 3 분 동안 건조한 공기에 내장 할 수 있습니다. </li><li> 다음, 정착 시간의 나머지 정착액 2 ㎖와 소장의 상부 커버, 2 분 동안 트랜스 웰 아래 정착액 1 ㎖를 추가한다. 4 ° C 또는 실온에서 2 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 O / N으로 수정합니다. </li></ol></li></ol> 고정 창자의 2 이미징 <ol><li> Wholemount 영상 <ol><li> 1X DPBS 100 ㎕와 슬라이드 (내생​​ 형광 포함) 전체 창자를 놓습니다. 부드럽게 장을 마련하기 위해 집게를 사용합니다. </li><li> 조직 개월을주의 깊게 70 % 글리세롤 100 μl를 DPBS를 제거하고 즉시 추가 실험실 조직을 사용하여투명 재 및 이미징의 가능한 깊이를 증가시킨다. NOTE : 소장의 상기 관통 원하는 경우, 대신에 70 % 글리세롤에 실장 부위에, 10 ~ 30 분 동안 초점 클리어 용액 몇 방울의 소장 소크. 초점 클리어 솔루션을 피펫 및 마운트 클리어와 장을 마운트합니다. </li><li> 모델링 점토로 커버 슬립의 네 모서리를 각각 담궈 부위를 평탄화로부터 커버 슬립을 유지하는 슬라이드 및 커버 슬립 사이에 스페이서로서 사용하는 점토를 소량 픽업. </li><li> 면봉으로 적용 녹은 VALAP와 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉합니다. </li><li> 이미지 중 하나를 세우거나 거꾸로 공 초점 현미경에 내장. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. </li></ol></li><li> (장 구조의 단면도에 대한) 고정 장의 Vibratome의 절편 <ol><li> 작은 플라스틱 금형 7 % 아가로 오스에 포함 된 장에 (10 × 10 × 15mm) 허용 아가로 오스 블록냉각 및 응고. </li><li> 순간 접착제와 vibratome 수집 단계에 플라스틱 금형 및 접착제 아가로 오스 블록에서 아가로 오스 블록을 제거합니다. </li><li> 얼음 차가운 1X DPBS와 컬렉션 무대를 채 웁니다. </li><li> 100 ~ 150 μm의 사이에 두께 부분을 잘라. 두꺼운 부분은 단면에 깊은 시각화 (2.1.2 참조) 청산 솔루션을 사용하십시오. </li><li> 4 ° C에서 저장을위한 6 웰 플레이트의 우물에 수집 단계부터 vibratome 섹션을 붓는다. </li></ol></li><li> 고정 vibratome 단면 조직의 면역 형광 염색 <ol><li> 1X DPBS와 함께 24 웰 플레이트에 잘 당 5-12 vibratome 섹션을 배치합니다. </li><li> 1X DPBS를 제거하고 잘 당 permeabilization 용액 500 μl를 추가합니다. 부드럽게 실온에서 25 분 동안 샘플을 바위. </li><li> permeabilization 후 1X PBS로 샘플을 3 회 씻는다. </li><li> 차단 솔루션의 500 μL에 적어도 30 분 동안 샘플을 차단합니다. </li><li> 차단, 전자 후차단 솔루션에 희석 차 항체의 500 μL와 차단 솔루션을 체인지와 4 ° CO / N에서 샘플을 유지합니다. 참고 : 냉동 식품 및 파라핀 섹션에서 잘 작동 차 항체 희석은 일반적으로 그러나 일반적으로 프로토콜 (예를 들어, BrdU의) 잘 작동하지 않는 핵 항원 검색을 필요로하는 항체도 vibratome 섹션에서 잘 작동합니다. </li><li> 다음 일, 차단 솔루션으로 15 분 동안 샘플 때마다 세 번 씻는다. </li><li> 세안 후, 차단 솔루션에 희석 차 항체의 500 μl를 적용합니다. 실온에서 2 시간 45 분 동안 샘플을 빛으로부터 형광을 보호하고 바위에 알루미늄 호일에 24 웰 플레이트를 감싸. </li><li> 15 분마다 1X PBS로 샘플을 3 회 세척하고 2.4 절에 설명 된대로 슬라이드 vibratome 섹션을 탑재합니다. </li></ol></li><li> vibratome 섹션을 장착 <ol><li> vibratome 두 번 STI의 얇은 조각을 절단하여 장착 슬라이드를 준비CK 테이프와 슬라이드의 긴 측면을 따라 그들을 배치. </li><li> 조심스럽게 1X PBS 100 ㎕의 드롭 슬라이드에 두 번 스틱 테이프 사이에 5 ~ 10 vibratome 섹션을 배치합니다. </li><li> 모든 섹션을 펼치고 슬라이드에 걸쳐 단일 층으로 그들을 밖으로 확산. </li><li> 평면 앉아에서 커버 슬립을 방지 할 수 초과 아가로 오스 또는 고르지 않은 비트를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 vibratome 섹션 주위에서 초과 1X PBS를 흡수하기 위해 연구소 조직을 사용합니다. </li><li> vibratome 부 위에 장착 수성 매질의 드롭을 추가 한 후 커버 슬립. </li><li> VALAP가 면봉으로 적용 용융와 슬라이드로 된 커버를 밀봉. </li><li> 이미지 중 하나를 세우거나 거꾸로 공 초점 현미경에 vibratome 섹션. 영상 시스템의 선택에 대한 더 자세한 설명을 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 전체 창자의 3 라이브 영상 창자 fetuse에서 수확연결된 대망가 그대로 유지와의 E12.5 후, 성공적으로 위의 시스템을 사용하는 문화에 융모을 개발한다. 따라서이 시스템은 생체 시간 경과 형태 형성의 3 차원 뷰를 위해 재구성 될 수있는 현상 장의 라이브 Z 단면 영상의 캡쳐를 허용한다. <ol><li> 라이브 영상 설정 <ol><li> 좋은 메쉬 화면으로 개별 폴리 카보네이트 막을 부착 순간 접착제를 사용합니다. 이 수직으로 공 초점 현미경의 침지 렌즈 아래 장소에 소장을 보유하는 지원 발판을 제공합니다. 라이브 영상 현미경의 선택에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. </li><li> 중앙 잘 문화 판에 메쉬 스크린을 놓습니다. </li><li> 폴리 카보네이트 막에 해부 장을 놓고 양쪽 끝에 순간 접착제 한 방울을 추가 할 수 있습니다. 장을 부착시킬만큼의 접착제를 사용하지만 코트 그것! </li><li> 폴리 카보네이트 아래 페놀 레드의 문화 미디어 무료 추가중심도의 문화 판에서 막. </li><li> 습도를 제공하도록 배양 플레이트의 외연에 물을 첨가. </li><li> 이미징 동안 대장의 움직임을 제어하는​​ 미디어 3 ㎖에 1X PBS에서 자일 라진 (xylazine)의 다섯 솔루션 : 태아 소장은 문화 수축의 연동과 같은 파도를 겪는 때문에, 하나의 100 μl를 추가합니다. 이 투여 량은 융모 발달을 손상시키지 않고 약 8 ~ 10 시간 동안 장 움직임을 제어합니다. </li><li> 소장의 가로보기의 경우, 3 ~ 4 % 아가로 오스 솔루션의 라이브 창자를 포함하고 vibratome에 두꺼운 부분 (150 ~ 500 μm의) 잘라. 절단되는 소장의 강성 아가로 오스의 강성을 일치하고 경험적으로 발달 단계를 결정했다. 일반적으로, 3 % 아가로 오스 솔루션은 E14.5 미만의 창자에서 잘 작동하고 4 % 용액은 창자 E15-E16에 적합합니다. </li><li> (섹션 3.1.1에서와 같이) 메시 스크린에 부착 된 폴리 카보네이트 멤브레인 vibratome 섹션을 붙인문화는 제 3.1.2-3.1.6에서 설명. </li><li> 동조 테이블 직립 스탠드 이광자 형광 공 초점 현미경 (690-1,040 nm의 사이 여기 레이저)를 이용하여 실시간 이미징을 수행. </li><li> 이광자 레이저 GFP 신호 최상의 해상도 깊은 용입을 제공 내지 900에 동조. 이미징 동안은 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 또한, 가능한 최저로 발광 레이저의 파워를 설정하는 조직 손상을 줄여 준다. 통상적으로, GFP의 좋은 자극을 구하는 이광자 레이저에 12 % 전력을 사용한다. </li></ol></li></ol>

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동적 특성 및 개발 소장의 복잡한 조직 상호 작용은 이러한 형태 발생 이벤트의 전체 감사의 마음을 가지고 3D 시각화가 필요합니다. 이미징 기술 진화로, 능력 개발 / 개선과 함께, 기관 형성기 동안 공간 의사 소통과 상호 작용의 이해가 크게 향상되어 자세히 융모 형태 형성을 검사합니다. 전체 창자 배양 방법에 대해서도 테스트되었지만, 트랜스 웰 시스템은 긴 배양 시간에 대한 정상적인 클러스터 및 융모 패터닝을 유지하기위한 가장 신뢰할 남아있다. 입체 문화 시스템 (매트 리겔이나 콜라겐은) 젊은 창자 (E12.5-E15.5)의 짧은 배양 기간 (이하 24 시간) 잘 작동하지만, 창자는 효소와 폐기물을 연동 같은 움직임을 겪고 분비 시작하면 루멘으로 3 차원 기판은 잘 유지되지 않습니다. 액체 배양에서 창자의는, 그러나, 자유 부동 문화 방향에 대한 지원 또는 기준의 부족을 개발 클러스터 및 융모의 일반적인 패턴을 변경하기 위해 나타납니다. 따라서, 트랜스 웰 시스템은 클러스터...

각 장 융모는 상피 표면층과 중간엽 코어의 두 가지 주요 조직 구획으로 구성됩니다. 쥐의 소장은 배아 10일째에 내배엽 시트가 닫히고 밀봉되어 중간엽 세포로 둘러싸인 상피관을 형성할 때 형성됩니다3. 이 편평한 상피관은 급속한 증식을 겪으며 길이와 둘레가 모두 성장하고 역동적인 세포 모양 변화를 수반하는 극적인 재배열을 겪습니다1. 동시에 주변 중간엽은 혈관신경총(vascular plexus)의 형성, 평활근의 분화, 장 뉴런(enteric neuron)의 동원 등 많은 발달 과정을 거칩니다4. 배아 14.5일에 근위 소장에서 고슴도치 및 PDGF 반응 세포의 응축(클러스터)이 상피2,5에 인접하여 형성되기 시작합니다. 중간엽 군집(mesenchymal cluster)의 형성은 장의 길이를 따라 계속 퍼져 나가 배아일(embryonic day)까지 소장 전체를 덮는다 16.52. 중간엽 클러스터가 형성됨에 따라 클러스터에 가장 가까운 상피 세포는 세포 주기에서 물러나기 시작하고 다른 상피 세포는 계속 증식합니다. 세포주기에서 물러난 중간엽 클러스터 바로 위의 세포는 떠오르는 융모가 내강으로 휘어짐에 따라 모양이 변하기 시작합니다. 융모의 추가 성장은 부분적으로 신흥 융모 사이의 상피의 지속적인 증식에 의해 주도됩니다. 중간엽 클러스터는 성장하는 융모의 상피에 단단히 부착된 상태로 유지되며 다양한 신호 분자를 계속 발현합니다. 융모 출현의 파동은 중간엽 클러스터(mesenchymal cluster)가 형성된 후 소장의 길이를 따라 전파됩니다. 장이 계속 성장하고 융모간 영역이 신흥 융모 사이로 확장됨에 따라 융모간 상피에 인접한 새로운 중간엽 클러스터가 형성되고 융모의 출현 및 성장이 계속됩니다6.
상피와 중간엽의 동기화된 발달은 융모 형태 형성에 필수적입니다. 신호 분자는 한 층에서 다른 층으로 분비되며, 수용체는 상피와 중간엽 사이의 발달을 조정하기 위해 신호 메시지를 수신하고 전달합니다. 중간엽 클러스터(mesenchymal clusters)는 신호 중추 역할을 하며 다양한 발달 모르포겐(developmental morphogens)7-10을 발현합니다. 클러스터 형성 또는 패턴의 중단은 융모 출현 및 패턴의 손실을 초래합니다. PDGF 신호전달의 억제는 더 적은 수의 군집과 융모를 초래하며, 형성되는 융모는 비정상적인 군집을 따라 기형이 된다11. 고슴도치 신호의 손실은 클러스터 형성의 완전한 손실과 융모 출현의 실패를 초래합니다2,12. 이러한 데이터는 클러스터가 중간엽 코어와 융모 상피의 발달을 조정한다는 것을 보여줍니다.
이 전체 장기 배양 시스템을 사용하여 상피-중간엽 클러스터 누화와 관련된 신호를 변경하여 융모 형태 형성에서 이러한 신호의 역할을 결정할 수 있습니다. 이광자 컨포칼 광학 절편 및 재구성을 통해 클러스터 형성 및 융모 출현을 3차원으로 시각화하고 중간엽 클러스터와 그 위에 있는 상피 사이의 공간적 관계를 더 잘 이해할 수 있습니다. 배양 시스템을 4차원으로 확장하면 시간이 지남에 따라 발달하는 클러스터와 융모의 z 스택을 캡처하고 이러한 상호 작용을 관찰할 수 있습니다. 궁극적으로, 이러한 방식으로 융모 발달을 추적하고 변경된 신호전달로 인해 발생하는 변화를 관찰할 수 있는 능력은 융모 형태 형성에서 상피 중간엽 상호 작용에 대한 이해에 혁명을 일으킬 것입니다.

<table><tbody><tr><td>세밀하게 해부하는 집게&nbsp;</td><td>고급 과학 도구</td><td>&nbsp; 11254-20</td><td>2 쌍</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x 멸균 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>&nbsp; </td><td></td>451007</tr><tr><td>트랜스웰 플레이트, 24mm 인서트, 8.0mm 폴리카보네이트 멤브레인</td><td>Corning Costar&nbsp;</td><td>3428</td><td>플레이트당 6개의 인서트</td></tr><tr><td>BGJb 매체</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10,000U/ml 페니실린; 10,000 mg/ml 스트렙토마이신)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 15140</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A0278</td>은 <td>5 mg/ml 스톡, 필터, 부분 표본을 만들고 -20°C에서 보관합니다. C</td></tr><tr><td>Mouth 피펫 (Drummond 1-15 인치 흡인 튜브 어셈블리)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 21-180-10</td><td>흡인기 어셈블리를 제거하고 1,000 &micro로 교체하십시오. l 6인치 유리 파스퇴르 피펫을 꽂는 어댑터 역할을 하는 피펫 팁.</td></tr><tr><td>6인치 유리 파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>모세관</td><td>세계 정밀 기기&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>풀 투 니들</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드는</td><td></td><td></td><td>1 x PBS에서 만들어졌으며, pH는 7.3</td></tr><tr><td>배양 플레이트</td>로 제작되었습니다. 팔<td>콘&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>353037 철물점에서</td><td></td><td></td><td>미세 메쉬 스테인레스 스틸 스크린</td> 구매</tr><tr><td>폴리 카보네이트 멤브레인</td><td>토마스 과학&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>대안적으로, Transwell 지원에서 Corning Costar 3428 막을 잘라내</td></tr>십시오<tr>. <td>철물점</td> 젤 기반의<td>즉시 접착제</td> 구매 <td>바람직하게</td><td></td></tr>는 <tr><td>35 x 10 mm 플레이트</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>7% 아가로스</td><td>시그마</td><td>&nbsp; A9414</td>는 <td>1x DPBS에서 w/v를 준비하고, 가열하여 수조에 용해시킵니다.</td></tr> Fine <tr><td></td><td>Science Tools&nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 프리 미디어 (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>자일라진 (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>기저막 매트릭스, 성장 인자 감소, 페놀 레드-프리</td></tr><tr><td>3-4% 아가로스</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A9414</td><td>1x DPBS에서 w/v를 준비하고 가열하여 수조에 용해</td></tr><tr><td>고정 장의</td><td></td><td></td><td></td>이미징</tr><tr><td>재료/장비</td><td>이름 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트/설명</td></tr><tr><td>VALAP</td>을 만드는 데 사용되는 약국 <td></td> 에서<td>바셀린</td> 구매<td>: 동일한 비율의 바셀린, 라놀린, 파라핀</td></tr><tr><td>라놀린</td><td>Sigma&nbsp;</td>VALAP을 만드는 데 사용되는 <td>L7387</td><td>: 바셀린, 라놀린, 파라</td></tr>핀 파라핀과 동일한 비율의 <tr><td></td><td>Surgipath</td><td>39601006</td> VALAP을 만드는 데 사용됨: 1 x PBS <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Focus clear 및 Mount Clear CelExplorer Labs Co.에 바셀린, 라놀린, 파라핀<td>70% 글리세롤과</td></tr> 동일한 비율로 사용됩니다<tr><td></td><td>.</td><td>&nbsp; F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>미술 용품점에서</td><td></td><td></td><td>모델링 점토</td> 구매</tr><tr><td>더블 스틱 테이프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>면 애플리케이터 면봉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 금형, 10mm x 10mm x 5mm)</td><td>티슈 텍&nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 와이프</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>보푸라기 없는 섬세한 작업 와이프</td></tr><tr><td>Theiler 스테이징 차트&nbsp;</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ 다운로드/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Leica SP5X 컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>라이카</td><td></td><td>는 라이브 이미징을 수행하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>라이카 DMI 6000 스탠드&nbsp;</td><td>라이카</td><td></td><td>는 라이브 이미징을 수행하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>수성 장착 매체 (Prolong Gold)</td> <td>분자 프로브&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>재료/장비</td><td>회사</td> 이름 <td>카탈로그 번호</td><td>설명/설명</td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>&nbsp; 3524</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마&nbsp;</td><td>T-8787</td>은 <td>투과화 용액을 만드는 데 사용됩니다: 0.5% Triton X-100은 1 x PBS</td></tr><tr><td>염소 세럼</td><td></td><td></td>을 <td>만드는 데 사용됩니다: 4% 염소 세럼, 0.1% Tween20은 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20을 만듭니다.</td><td>시그마</td><td>&nbsp; P9416</td><td></td></tr></tbody></table> (영문)

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 vivo 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

태아 소장에서 대부분의 형태 형성 과정은 발달 단계를 통해 변화의 스냅 샷을 제공하는 고정 된 조직의 얇은 섹션에서 유추되고있다. 얇은 시리얼 섹션에서 세 가지 차원 정보로 인해 완벽하게 시리얼 섹션을 재구성 시리얼 섹션을 통해 조직의 올바른 방향을 유지의 어려움의 해석에 도전 할 수 있습니다. 그로 의해 외. 최근 연구 결과, 2011은 한 부위의 현상 융모의 형태 형성을 이해 삼차원 정보의 중요성을 강조. 단독 표지 장 세포의 3 차원 재구성은 장 상피 세포의 대부분은 모두 혀끝과 기저 표면에 문의하는 것이 보여 주었다. 더욱이, 상피의 선 단면에서 액틴 세포 골격의 삼차원 재구성 장내 루멘 연속이며 그 보조 루멘 (S)의 이슈임을 입증ectioning. 그 두 점은, 장 상피 세포에서 interkinetic 핵 마이그레이션 시연과 함께 pseudostratified 상피 세포로 개발하는 장 상피 세포를 정의하고 이전에 한 생각으로 계층화 없습니다. 상피 세 차원을 관찰 할 수있는 능력은이 점을 증명하고 태아 소장에서 상피 형태 형성을 재정에 정액이었다. 다중 광자 이미징 기술 및 3 차원 재구성 소프트웨어의 발전으로, 능력은 급속히 향상되고 장기 개발, 그대로 시각화. 이광자 여기는 고해상도 조직에 덜 파괴적인 침투를 깊게한다. 두 광자 이미징 및 월튼 등.에 전체 태아 마우스 내장의 3 ​​차원 복원은 2012 융모 파생물이의 패턴을 정의하는 데 도움을 주었다. 여기에서는 허용하도록 그 배양 시스템의 융모와 확장 생체 개발을 허용 전체 기관 배양 시스템을 설명창자는 세 가지 차원으로 자신의 개발 기간 동안 이미지를 만들 수 있습니다.

이 시스템은 약리학 적 시약 또는 재조합 단백질과 시그널링의 조작을 가능으로 태아 내장의 전체 이식편의 배양은, 장 개발 좌표 시그널링 분자의 위치, 분포, 및 지속 시간의 분석을 허용한다. (월튼 외로부터 재생도 1a., 2012) 트랜스 웰 배양 시스템 (2)은 가능한 조직에 약물이나 단백질 침지 아가 로스 비드를 배치함으로써, 로컬 신호 원을 확립하게 공기 - 액체 계면 (도 1b드립니다 ). E10에서 E18.5에 배아에서 수확 창자는 트랜스 웰에 문화에서 생존과 움직임의 연동과 같은 파도를 받아야. 창자는 십일 정도 생존 또는 거칠게 P3, 토굴 형성이 첫번째 관찰 마우스 개발 단계에 E13.5에서 문화를 시작했다. 초기 단계의 창자 문화에서 생존하지만, 창자는 이전에 수확장막이 완전히 그 시간을 기준으로 소장 다루 성장하지 않았기 때문에 E12.5은 안정적 가능성이 융모 등장하지 않습니다. 월튼 등...

향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 외에서 마우스 배아 장의 전체 장기 배양을 성장시켜 세포 신호 경로의 조절을 허용하는 것입니다. 이것은 배아 12.5일에서 18.5일 사이에 태아로부터 쥐의 장을 먼저 채취함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 장을 트랜스웰 배양 또는 라이브 이미징 배양 플레이트에 배치하는 것입니다.다음으로, 세포 신호 경로 또는 장소의 약리학적 억제제로 준비된 배지로 장을 처리합니다. 아로는 재조합 단백질에 흠뻑 젖어 장 위의 세포 신호를 변경합니다. 마지막 단계는 배양된 장을 두꺼운 바이옴 절편 또는 구멍 마운트에서 이미징하는 것입니다.궁극적으로, 컨포칼 이미징과 3차원 재구성을 사용하여 세포 신호 경로의 조절이 융모 형성 중 조직층의 발달에 어떤 영향을 미쳤는지 시각화합니다. 이 방법의 시각적 시연은 배아 조직이 매우 섬세하고 해부 및 취급 시 세심한 주의가 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 해부를 준비하려면 해부 도구를 70% 에탄올에 담그십시오.6개의 웰 배양 플레이트와 BGJB 미디어가 있는 10cm 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 안락사된 태아의 내장을 제거합니다. X-D-P-B-S 단위로 하나씩 해부합니다.위에서 비장을 조심스럽게 제거한 다음 위에서 췌장과 상부 십이지장을 제거합니다. 그런 다음 오멘텀을 부드럽게 분리하여 가능한 한 부착된 상태로 두고 장이 곧게 펴질 수 있을 만큼만 연결을 분리합니다. 그런 다음 작동하는 BGJB 매체가 있는 10cm 페트리 플레이트에 샘플을 넣습니다.다음으로, 구강 피펫을 사용하여 장 조각을 배양 플레이트의 트랜스웰로 옮깁니다. 트랜스웰 아래에서 미디어를 제거합니다. 그런 다음 트랜스 아래에 700마이크로리터의 처리 매체를 추가합니다.그런 다음 300마이크로리터의 처리 매체를 장에 적가하고 트랜스웰을 통해 스며들게 합니다. 처리 시약의 반감기에 따라 적어도 하루에 한 번 또는 더 자주 처리 매체를 교체하십시오. 또는 모세혈관 바늘을 당긴 입 피펫을 사용하여 어그로 비드를 장에 부드럽게 놓습니다.거칠게 다루면 장이 손상되고 부상 부위의 융모 발생을 방지할 수 있으므로 구슬을 매우 주의해서 놓으십시오. 이 절차에서는 작은 플라스틱 틀에 장을 7% aros에 삽입하고 aros 블록이 냉각되고 응고되도록 합니다. 그런 다음 플라스틱 금형에서 aros 블록을 제거합니다.아로스 블록을 인스턴트 접착제로 Vibram 수집 단계에 붙입니다. 다음

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연구

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이 비디오에서는 쥐의 장 조직 조각과 특정 장내 세균 간의 상호 작용을 연구하기 위해 생체 외 장 장기 배양 시스템을 설정하는 방법론을 설명합니다. 이 장치는 두 쌍의 입력-출력 포트로 구성되며, 첫 번째는 장 조직 내강을 연결하고 특정 박테리아 현탁액을 공급하고, 두 번째는 생체 외 조직 생존력을 유지하기 위해 장치의 웰에 매체를 지속적으로 공급합니다.

숙주-미생물총(Microbiota) 상호작용을 연구하기 위한 생체 외 장기 배양 시스템

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

생체 외 직립 액적 배양은 현재의 시험관 내 및 생체 내 실험 기술의 대안입니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 더 적은 양의 시약이 필요하며 태아 혈관화, 형태 형성 및 기관 형성을 조작하고 연구할 수 있는 기능을 허용합니다.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

이 프로토콜은 혼합 된 쥐의 소장 세포의 분리 및 문화에 대해 설명합니다. 이러한 기본 장 배양 기법들을 사용하여 장내 펩타이드 분비 하부 신호 전달 경로의 조사를 가능하게한다.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

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에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

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