에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

이 절차의 전반적인 목표는 생체 외에서 마우스 배아 장의 전체 장기 배양을 성장시켜 세포 신호 경로의 조절을 허용하는 것입니다. 이것은 배아 12.5일에서 18.5일 사이에 태아로부터 쥐의 장을 먼저 채취함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 장을 트랜스웰 배양 또는 라이브 이미징 배양 플레이트에 배치하는 것입니다.

다음으로, 세포 신호 경로 또는 장소의 약리학적 억제제로 준비된 배지로 장을 처리합니다. 아로는 재조합 단백질에 흠뻑 젖어 장 위의 세포 신호를 변경합니다. 마지막 단계는 배양된 장을 두꺼운 바이옴 절편 또는 구멍 마운트에서 이미징하는 것입니다.

궁극적으로, 컨포칼 이미징과 3차원 재구성을 사용하여 세포 신호 경로의 조절이 융모 형성 중 조직층의 발달에 어떤 영향을 미쳤는지 시각화합니다. 이 방법의 시각적 시연은 배아 조직이 매우 섬세하고 해부 및 취급 시 세심한 주의가 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 해부를 준비하려면 해부 도구를 70% 에탄올에 담그십시오.

6개의 웰 배양 플레이트와 BGJB 미디어가 있는 10cm 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 안락사된 태아의 내장을 제거합니다. X-D-P-B-S 단위로 하나씩 해부합니다.

위에서 비장을 조심스럽게 제거한 다음 위에서 췌장과 상부 십이지장을 제거합니다. 그런 다음 오멘텀을 부드럽게 분리하여 가능한 한 부착된 상태로 두고 장이 곧게 펴질 수 있을 만큼만 연결을 분리합니다. 그런 다음 작동하는 BGJB 매체가 있는 10cm 페트리 플레이트에 샘플을 넣습니다.

다음으로, 구강 피펫을 사용하여 장 조각을 배양 플레이트의 트랜스웰로 옮깁니다. 트랜스웰 아래에서 미디어를 제거합니다. 그런 다음 트랜스 아래에 700마이크로리터의 처리 매체를 추가합니다.

그런 다음 300마이크로리터의 처리 매체를 장에 적가하고 트랜스웰을 통해 스며들게 합니다. 처리 시약의 반감기에 따라 적어도 하루에 한 번 또는 더 자주 처리 매체를 교체하십시오. 또는 모세혈관 바늘을 당긴 입 피펫을 사용하여 어그로 비드를 장에 부드럽게 놓습니다.

거칠게 다루면 장이 손상되고 부상 부위의 융모 발생을 방지할 수 있으므로 구슬을 매우 주의해서 놓으십시오. 이 절차에서는 작은 플라스틱 틀에 장을 7% aros에 삽입하고 aros 블록이 냉각되고 응고되도록 합니다. 그런 다음 플라스틱 금형에서 aros 블록을 제거합니다.

아로스 블록을 인스턴트 접착제로 Vibram 수집 단계에 붙입니다. 다음으로 수집 단계를 얼음처럼 차가운 X-D-P-B-S로 채웁니다. 100-150 마이크로 미터 두께로 섹션을 자릅니다.

그런 다음 수집 단계의 섹션을 섭씨 4도에서 보관하기 위해 6개의 웰 플레이트의 우물로 옮깁니다. 장착을 위해 슬라이드를 준비하려면 각 슬라이드의 긴 슬라이드를 따라 양면 테이프를 붙입니다. 그 위에 XPBS 한 방울을 떨어뜨립니다.

그런 다음 슬라이드에 5-10개의 섹션을 조심스럽게 놓습니다. 모든 섹션을 펼치고 단일 레이어로 펼칩니다. 슬라이드 건너편.

커버 슬립이 평평하게 놓이는 것을 방해하는 과도한 아로나 고르지 않은 부분을 제거하십시오. 실험실 티슈를 조심스럽게 사용하여 섹션 주변에서 여분의 XPBS를 흡수합니다. 다음으로 섹션 상단에 수성 장착 매체를 떨어뜨립니다.

그런 다음 커버 슬립을 그 위에 놓고 녹은 증기로 슬라이드에 밀봉합니다. 그런 다음 정립 또는 도립 컨포칼 현미경에서 바이옴 단면을 이미지화합니다. 이제 인스턴트 접착제를 사용하여 개별 폴리카보네이트 멤브레인을 미세한 메쉬 스크린에 부착합니다.

배양 플레이트의 중앙 웰에 메쉬 스크린을 놓습니다. 그런 다음 절개된 장을 폴리카보네이트 멤브레인에 놓고 각 끝에 인스턴트 접착제 한 방울을 추가합니다. 다음으로, 배양판의 중앙 웰에 있는 폴리카보네이트 멤브레인 아래에 페놀이 레드가 없는 배양 배지를 추가합니다.

배양 플레이트의 바깥쪽 가장자리에 물을 추가하여 습도를 제공합니다. 태아의 장은 배양에서 수축파와 같은 연동 운동을 겪기 때문에 플레이트의 중앙 웰에 있는 3ml의 배지에 100마이크로리터의 자일라진 용액을 첨가하여 이미징하는 동안 장의 움직임을 제어합니다. 직립 스탠드에서 두 개의 광자 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 라이브 이미징을 수행합니다.

여기에 표시된 것은 본 명세서에서 ecat으로 염색된 갓 수확된 E 14, E 15 및 E 16 십이지장 조직의 단면과 dpi입니다. 이 장 분절은 E 14에서 수확하고 2일 동안 배양했습니다. E 14에서, 모델링되지 않은 상피는 여전히 유사 성층화되어 있었다.

배양에서 이틀 후에 VII가 보이지만 vii에 비해 약간 지연됩니다. E 16에서는 E 14 십이지장에서 pcam 염색된 혈관 구조의 광학 단면을 3차원으로 재구성한 것이며, 이 그림은 항체 면역형광 염색된 E 15.5 viome 절편 창자에서 컨포칼 이미지를 3차원으로 재구성한 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배아 조직을 해부하고, 전체 장기 배양을 위해 장을 설정하고, 고품질 3차원 이미징을 위해 조직을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.