해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

이 절차의 전반적인 목표는 초파리, 동공 고환 및 생식세포 낭종의 생체 외 배양을 준비하여 실시간 이미징 연구 및 억제제 치료를 수행하여 근육 형성을 위해 퓨륨 형성 후 24시간 후 초기 puy에서 온전한 고환을 먼저 해부하여 수행하는 것입니다. 두 번째 단계는 이러한 고환에서 단일 생식세포 낭종을 해부한 다음 온전한 고환과 단일 생식세포 낭종을 라이브 이미징 실험에 사용할 수 있습니다. 또는 다음 단계는 손상되지 않은 고환 또는 생식세포 낭종을 억제제 화합물로 배양하는 것입니다.

궁극적으로 호박, 고환 및 형광 현미경의 면역 염색을 사용하여 치료 효과를 모니터링합니다. 기존 유전 방법에 비해 이 생체 외 배양 기술의 주요 장점은 miotic 후 단계에서 dilo 정자 형성에 접근할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 동공 조직을 해부하고 다루어야 하는 일부 경험 때문에 어려움을 겪습니다.

실험을 시작하려면 80마이크로리터의 방패 방울과 소 태아 혈청 및 항생제가 함유된 San M 3개의 곤충 배지를 10cm 페트리 접시에 분배합니다. 다음으로, 넓은 집게를 사용하여 번데기를 골라 접시의 중간 방울로 옮깁니다. 그런 다음 광섬유 조명기가 장착된 실체 현미경으로 재료를 옮깁니다.

5번 집게를 사용하여 해부하는 동안 고환을 실온 이상으로 가열하지 않도록 주의하십시오. 번데기의 가장 뒤쪽 끝을 잡고 제자리에 고정합니다. 다른 한 쌍의 집게로 앞쪽 구형을 잡고 앞쪽 끝에서 동공을 열고 파마를 합니다.

흉부의 적어도 일부가 노출될 때까지 동공 케이스를 벗겨냅니다. 번데기의 가장 뒤쪽 끝을 잡고 번데기의 머리 부분에 집게의 두 팔을 삽입하여 번데기의 내부 압력을 해제합니다. 다음으로, 집게를 열고 집게를 앞쪽 방향으로 움직여 번데기를 뜯어내고 첫 번째 시도에서 구멍이 가능한 한 큰지 확인합니다.

압력이 해제되기 전에 번데기의 뒤쪽 끝이 손상되지 않도록 하십시오. 이로 인해 고환이 작은 구멍을 통해 직접 밀려 손상될 수 있습니다. 번데기가 열리면 번데기의 방출된 내부 압력이 큰 구멍을 통해 지방체 세포와 조직의 사구체를 밀어냅니다.

그런 다음 한 쌍의 집게를 사용하여 구멍의 크기를 늘리고 고환이 손상될 수 있으므로 집게로 번데기를 쥐어짜지 마십시오. 다음으로, 번데기의 가장 뒤쪽 끝을 가까이 잡습니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 번데기에서 고환을 방출하기 위해 번데기의 내용물을 후방에서 전방으로 부드럽게 줄무

동공 고환이 밖으로 밀려나왔는지 확인합니다. 그들은 다른 조직과 연결되지 않습니다. 24시간이 되면 PF가 미리 절단된 200마이크로리터 피펫 팁으로 고환을 수집합니다.

고환과 함께 운반되는 지방체 세포의 수를 줄이기 위해 소량의 배지만 전달합니다. 그런 다음 고환을 신선한 배양 접시에 배지에 놓습니다. 라이브 이미징을 위해 지방체 세포가 거의 남지 않을 때까지 중간으로 고환을 여러 번 세척합니다.

배지가 있는 유리 바닥 배양 접시에 고환을 옮기고 도립 이미징 현미경을 사용하여 해부를 시작합니다. 하나 이상의 동공 고환을 배지로 채워진 유리 바닥 배양 접시로 옮깁니다. 수컷 생식세포 낭종을 해부하기 위해 광섬유 조명이 있는 실체 현미경과 두 개의 스테인리스 스틸 바늘을 사용하십시오.

하나의 바늘을 조심스럽게 고정한 상태에서 하나의 고환을 앞쪽 또는 뒤쪽 끝에 놓고 제자리에 고정합니다. 다른 바늘을 고환에 삽입하고 바늘을 옆으로 움직여 고환초를 파괴하면 많은 낭종이 방출됩니다. 하나의 바늘로 고환을 제자리에 계속 유지합니다.

그런 다음 다른 바늘을 사용하여 고환에 남아 있는 낭종을 부드럽게 제거합니다. 다음으로 응집된 낭종을 분리합니다. 200 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 낭종을 배지가있는 신선한 배양 접시로 옮깁니다.

그런 다음 배양된 접시를 도립 이미징 현미경으로 옮겨 단일 낭종의 라이브 이미징을 수행합니다. 필요한 경우 바늘로 낭종을 다시 분산시키고 위상차 및 형광 현미경을 사용하여 낭종의 단계를 식별합니다. 원하는 단계의 낭종에 초점을 맞춥니다.

낭종의 초점과 위치를 자주 확인하십시오. 장시간의 이미징 실험 중에는 낭종이 배양 접시의 바닥에 달라붙지 않습니다. 초점에서 벗어나 떠오르려고 합니다.

12회 반복의 한 번의 실험을 위해 24웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 배지를 채웁니다. 그런 다음 미리 절단된 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 하나의 동공 고환을 각 웰로 옮깁니다. 다음으로, 도립 형광 현미경을 사용하여 고립된 고환에 프로타민이 있는지 확인합니다.

고환에는 프로타민, B-E-G-F-P 신호가 없어야 하며, 이는 히손에서 프로타민 또는 HP로의 전환이 어떤 낭종에서도 발생하지 않았음을 나타냅니다. 이미 양성 낭종을 보이는 고환을 교체하십시오. 억제 화합물인 엔도 카릭산(endo caric acid)을 함유한 배지 500마이크로리터를 첨가하여 처음 12개의 웰 각각에 1밀리리터당 150마이크로몰의 최종 농도에 도달합니다.

나머지 웰을 500마이크로리터의 배지에 용매를 첨가하여 처리되지 않은 대조군으로 사용합니다. 그런 다음 어둠 속에서 24시간 동안 섭씨 5도에서 플레이트를 배양합니다. 배양된 고환에 프로타민이 있는지 다시 확인하십시오.

이제 대조군 고환에 하나 이상의 프로타민, B-E-G-F-P 양성 낭종이 표시되어야 하며, 이는 HP 스위치를 통한 전이를 나타냅니다. 다음으로, 200마이크로리터 팁이 있는 피펫을 사용하여 고환을 폴리 L 라이신 코팅 슬라이드로 옮깁니다. 호박 준비를 수행하고 형광 항체로 염색합니다.

발표된 프로토콜에 따라, 이 해부 방법을 사용하여 초파리 고환의 위상차 이미지를 얻었습니다. 이것은 초파리 번데기의 약간 찌그러진 전체 산 고환입니다. PY 형성 또는 PF 정자 형성 후 24시간이 지나면 허브 영역 아래의 전방 끝으로 제한됩니다.

나머지 고환은 정자 세포로 채워지며, 네빈 현재 단계에서는 둥근 핵과 정자로 채워지며, 위상 대비의 편모 오버레이가 성장하면서 연장 단계에서 정자류, 가정 산 동공 고환에서 EGFP 및 RFP 형광 이미지를 얻어 24 시간 A PF에서 H 2 개의 A-V-D-R-F-P 및 프로타민 B-E-G-F-P를 검출했습니다. 정자 중 누구도 HP 스위치를 자주 받지 않았습니다. 이 단계에서 절개된 고환은 자가형광 구조를 포함하고 있습니다. 동공 고환을 36시간 절개합니다.PF는 첫 번째 프로타민인 B-E-G-F-P 양성 낭종을 나타냅니다.

동공 고환 48시간 A PF에는 눈에 보이는 프로타민 양성 핵이 있는 여러 생식세포 낭종이 있습니다. 배양에서 발달하는 전체 고환의 생체 외 시간 경과 라이브 이미지를 기록할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 동공 고환을 45시간 동안 절개하고 A PF를 6시간 동안 배지에서 배양하고 5분마다 이미지화했습니다.

이 기간 내에 HP 스위치 단계에서 정자류의 여러 낭종이 나타나 밝은 프로타민 B-E-G-F-P 신호를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 in vivo imaging 또는 inhibitor treatment를 수행하기 위해 배양에서 조기 동공 고환 및 단일 생식세포 낭종을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.