마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 메모리 지방 패드에서 종양 세포 생착 후 유방 세포 진행을 조사하는 것입니다. 이것은 유방암 세포를 성인 마우스의 기억 지방 패드에 주입한 다음 미리 결정된 시간 수준에서 캘리퍼로 종양 부피를 측정함으로써 수행됩니다. 실험이 끝나면 종양의 질량과 부피를 측정하고 추가 분석을 위해 동물의 혈액과 폐를 적출합니다.

궁극적으로 거시적 전이와 미시적 전이는 각각 시각적 및 면역조직화학적 분석으로 정량화할 수 있습니다. 피하 종양 세포 주사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 유방 지방 패드 주입 부위가 유방 종양 형성의 원래 부위를 모방하여 보다 신뢰할 수 있는 결과를 산출한다는 것입니다. 이 방법은 암 진행에 관여하는 종양, 억제 인자, 종양 유전자 또는 기질 구획 구성 요소와 같은 유방암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

시술 하루 전, N-O-D-S-C-I-D 감마 마우스를 네 번째 젖꼭지에서 정중선까지 면도하고 무게를 측정하여 모든 동물의 체중이 대략적으로 비슷한지 확인합니다. 다음날, PBS로 인간 유방 선암 세포 배양액을 한 번 세척한 다음 대부분의 세포가 분리되었을 때 트립스를 통해 세포를 항아리화합니다. DMEM 배지를 함유한 혈청 10ml로 반응을 담금질한 다음 실온에서 1, 200RPM으로 7분 동안 세포를 스핀다운하고 펠릿을 세척하여 혈청의 흔적을 제거한 다음 두 번째 펠릿을 PBS에 재현탁합니다.

계산 후, 150 마이크로 리터 농도 당 500, 000의 세포를 얼음 위의 멸균 마이크로 원심 분리기 튜브로 분취하십시오. 그런 다음 50ml 원뿔형 튜브 하나에 35ml의 PBS를 채우고 다른 튜브에 70% 에탄올을 채우고 각각 면봉을 담급니다. 각 동물을 위한 모든 도구가 준비되면 동물의 눈에 안과 연고를 바르십시오.

그런 다음 테이프를 사용하여 마취 중인 마우스를 가열 패드에 부드럽게 구속하고 발가락 꼬집기로 진정을 확인합니다. 에탄올을 적신 면봉을 사용하여 면도한 부위를 닦은 다음 메스 칼날을 사용하여 네 번째 젖꼭지와 정중선 사이를 작게 절개합니다. PBS에 적신 면봉을 절개 부위에 삽입하여 주머니를 만든 다음 핀셋을 사용하여 흰색으로 감지할 수 있는 메모리 지방 패드를 노출시킵니다.

다른 핀셋을 사용하여 지방 패드의 바닥을 짜고 조직을 완전히 노출시킵니다. 그런 다음 선암 세포를 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 균질한 세포 용액을 만들고 150마이크로리터의 세포를 인슐린 주사기로 부드럽게 흡인합니다. 바늘 구멍이 위를 향하도록 주사기를 수평으로 잡도록 주의하십시오.

세포를 유방 지방 패드에 주입하여 조직을 부풀어 올려 성공적인 주입을 확인합니다. 그런 다음 지방 패드를 부드럽게 풀고 모기 집게를 사용하여 절개 부위를 봉합하고 모기 집게 주위의 봉합사를 시계 방향, 시계 반대 방향, 시계 방향으로 돌려 세 개의 매듭을 만듭니다. 수술 후 진통제를 주사하고 각 동물을 흉골 자세로 누운 자세로 개별 케이지에 넣고 완전히 회복될 때까지 쥐를 모니터링합니다.

세포 이식 8주 후, 생쥐는 장기 적출을 준비합니다. 동물을 폼 베이스에 고정하고 캘리퍼를 사용하여 종양의 부피를 측정합니다. 다음으로 긴 수직 정중선 절개를 한 다음 앞다리 바로 아래와 뒷다리 위에 두 개의 수평 절개를 만듭니다.

피부를 폼에 고정하여 종양을 노출시킨 다음 가위를 사용하여 피부에서 종양을 분리합니다. 그런 다음 폐를 부드럽게 제거하고 왼쪽 폐를 Bowen's solution에 3일 동안 넣은 후 이 표재성 전이성 민간을 육안으로 명확하게 볼 수 있게 하고 나중에 RNA 분리를 위해 조직의 일부를 액체 질소로 동결하고 종양의 나머지 부분을 포르민으로 채워진 원뿔형 튜브 중 하나에 넣습니다. 다음으로, 심장 천자에 의한 동물의 희생 후, 450 마이크로 리터의 혈액 샘플을 3.2 % 구연산 나트륨 50 마이크로 리터가 들어있는 마이크로 원심 분리 튜브에 분배 한 다음 적혈구를 스핀 다운하고 세포의 부정확 한 접종 또는 누출과 같은 실험 오류가 종양 크기의 변동 또는 종양의 부재로 이어질 수 있습니다 종양 샘플이 발생할 때까지 섭씨 음의 20 도에서 저장합니다. 기억과 비슷하게 보이는 구조의 형성.

컨트롤 버퍼가 주입된 뚱뚱한 패드. 종양의 성장 속도는 또한 주입된 세포주의 특성에 따라 달라지며 일반적으로 마우스의 피부를 통해 관찰할 수 있습니다. 또한 종양 주변 부위에는 혈관 재형성으로 인해 발생하는 큰 혈관이 나타날 수 있으며, 이는 노폐물을 제거하고 종양 조직에 영양분과 산소를 공급하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다.

시험관 내 실험과 달리 종양 세포의 성장 속도는 저산소증과 영양 부족으로 인해 생체 내에서 시간이 일정하지 않을 수 있습니다. 괴사 부위는 주변 조직 내에 형성될 수 있으며, 이러한 부위는 종양의 성장 속도에 영향을 미칩니다. 또한, 관심 특정 유전자를 발현하는 주입된 세포는 유전자가 빠르게 시작되지만 종양 성장이 끝날 때 느려지거나 그 반대의 경우도 마찬가지이기 때문에 암 진행에 영향을 미칠 수 있습니다.

Bowen의 용액에서 폐를 수집하면 폐 조직 표면에 창백한 형태로 나타나는 표재성 전이성 병소를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 병소의 형성은 세포주에 따라 다릅니다. 비공격적인 세포는 미세 전이만 일으킬 수 있으며, 이는 파라핀 내장 폐 조직에서 H 및 E 염색으로 쉽게 확인할 수 있습니다.

이 절차에 따라 Eliza와 같은 다른 방법을 수행하여 실험 종양의 성장이 혈장 내 사이토카인 또는 혈관 신생 분자 수치에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.