다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

이 절차의 전반적인 목표는 손상되지 않은 조직에 있는 중심 뉴런의 가시 및 수상돌기와 같은 작은 세포 구획에서 나트륨 역학을 유발하고 분석하는 것입니다. 이는 먼저 급성 쥐 해마 절편을 준비하고, 패치 피펫을 통해 나트륨에 민감한 형광 염료 SBFI를 피라미드 뉴런에 로드하고, 다광자 여기를 사용하여 세포 형태를 시각화함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 실험을 위해 가시가 있는 수상돌기를 선택하고 Foley가 이 수상석에 가까운 케이지 글루타메이트와 같은 광활성화 화합물을 주입

그런 다음 선택한 수상돌기에 가까운 작은 부피를 대상으로 정확하게 배치된 UV 레이저를 사용하여 UV 플래시를 Foley의 언케이지드 글루타메이트에 적용합니다. 마지막 단계는 수상석에서 SBFI 형광의 결과적인 변화를 모니터링하고 인접한 가시에서 나트륨의 결과적인 변화를 모니터링하는 것입니다. 수반되는 멤브레인 전류도 기록됩니다.

궁극적으로 수용체 차단제와 같은 적절한 약리학적 도구를 사용하면 유발된 세포 내 나트륨 신호를 생성하는 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 이 방법은 작은 세포 구획과 온전한 뇌 조직에서 세포 내 나트륨 신호를 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다. 여기에서는 전체 세포 패치 클램프와 다광자 나트륨 이미징을 UV 광선 유도 언징징을 위한 수정된 절차와 결합합니다.

를 사용하면 신경 활성 화합물의 정확하고 집중적인 적용에 대한 세포 반응을 모니터링 할 수 있습니다. 이 절차는 Karl KA와 제 연구실의 대학원생인 Kaan Kleinhans가 시연할 것입니다. 조직 해부를 시작하려면 즉시 얼음냉 해부, 인공 뇌척수액 또는 A CSF가 있는 페트리 접시에 뇌를 넣고 정중선을 따라 시상 절단을 수행하여 반구를 해부합니다.

원하는 방향으로 두 번째 절단을 블로킹 표면으로 수행합니다. 그런 다음 이것을 슈퍼 접착제로 vibram의 절단 단계에 부착하십시오. 냉동실에서 비브람의 절단 챔버와 냉각 요소를 꺼낸 후 챔버의 뇌 섹션과 함께 절단 단계를 놓습니다.

그런 다음 냉각 요소를 챔버에 넣고 조직을 얼음 저온 해부 A CSF에 담그십시오. 다음으로 250마이크로미터 두께로 자릅니다. viome이 있는 해마의 Para sagittal slices.

CS 유체에 항상 거품이 발생하는지 확인하십시오. 자른 후 일반 A CSF가 있는 비커의 메쉬에 조직을 보관하고 섭씨 34도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후에는 조직을 실온에 보관하십시오.

이 실험은 어두운 환경에서 실행해야 하지만 여기서는 촬영 목적으로 어두운 조명 조건에서 표시됩니다. 먼저 하드웨어를 준비하려면 다광자 시스템의 구성 요소를 켜고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적외선 레이저 빔 정렬을 조정합니다. 그런 다음 pcal cell과 photo multipliers의 설정을 변경하여 multi photon laser 파장과 빔 강도를 조정합니다.

다음으로, 대물 렌즈 아래에 형광 샘플 슬라이드를 배치하여 언케이징 시스템을 켜고 보정합니다. 언케이징 장치 제어 소프트웨어의 교정 루틴을 시작합니다. UV 레이저를 스캔 범위 내의 여러 지점으로 설정하는 동안 UV 레이저 스폿을 클릭하여 CCD 카메라로 형광을 캡처합니다.

각 지점에서 갈바닉 스캔 미러의 위치를 소프트웨어의 특정 좌표에 맞게 조정합니다. 언케이지 스폿의 정확한 위치 지정은 언케이징 컴퓨터와 이미징 컴퓨터 간의 네트워크 연결을 통해 이미징 시스템의 이미지를 가져옴으로써 달성됩니다. 화면 그래버 소프트웨어를 사용하여 이미징 소프트웨어의 프레임을 지속적으로 읽고 이미징을 조정합니다.

그리고 완료된 케이지 프레임에서는 이미징 소프트웨어의 10번째 프레임마다 참조 이미지로 플래시 장치로 동시에 내보내 전체 실험 동안 적절한 조정을 보장합니다. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터 전기생리학 구성 요소와 압력 적용 장치를 켜서 케이지 화합물을 대상 영역으로 전달합니다. 전체 세포 패치 클램프를 위한 피펫을 당기고 화염 광택 보로 실리케이트 유리 모세관을 사용하여 국부적으로 풍부합니다.

그런 다음 슬라이스를 실험용 수조에 넣고 그리드로 고정하기 위해 수조를 현미경 스테이지에 놓고 A CSF로 슬라이스를 영구적으로 관류합니다. 패치 피펫에 세포 내 용액 또는 SBFI가 포함된 ICS를 로드하여 전체 세포 패치 클램핑을 시작한 다음 국소 관류 파이펫에 케이지 화합물을 로드합니다. 피펫을 해당 마이크로 매니퓰레이터에 부착하고 기준 전극을 수조에 놓습니다.

절편 표면에서 30-70마이크로미터 아래에 위치한 소마가 있는 CA one 피라미드 세포를 선택하여 손상되지 않은 세포 형태와 언케이징 빔의 낮은 산란 및 감쇠를 보장합니다. IR DIC 비디오 현미경을 사용하는 패치 피펫으로 이 세포에 접근합니다. 기가 씰이 얻어질 때까지 부드럽게 흡입합니다.

빠른 용량을 보상합니다. 그런 다음 멤브레인을 부수고 세포를 열어 세포 구성을 얻습니다. 마지막으로, 전류 클램프 모드에서 세포 생존율을 평가합니다.

탈분극 전류를 주입하고 그에 따른 스파이크 활동을 확인하여 이미징 및 자극을 수행합니다. 먼저 A CSF에 테트로 DOIND를 추가하여 전압 의존성 나트륨 채널의 활성화와 활동 전위의 생성을 방지합니다. 다광자 여기(multi photon excitation)와 그에 따른 SBFI 형광을 사용하여 세포 형태를 시각화할 수 있습니다.

실험을 위해 가시 수상돌기를 선택합니다. 더 높은 해상도의 이미지를 확대하고 덴드라이트 주위에 클립 상자를 배치합니다. 그런 다음 케이지 화합물이 있는 피펫을 수상석 근처에 놓습니다.

선택한 수상돌기의 효율적인 국소 관류가 가능하도록 피펫을 배치합니다. 언케이징 레이저를 조정하여 언케이징 지점을 관심 구조에 가깝게 배치합니다. 다음으로, 이미징 소프트웨어를 사용하여 선택한 수상돌기와 인접한 가시에 대한 관심 영역을 설정합니다.

관심 영역에 접근하고 트리거 신호를 통해 저압 시작 패치, 클램프 및 형광 기록으로 케이지 화합물을 몇 초 동안 주입합니다. 갇힌 화합물이 국부적으로 풍부해지는 동안 여기 빔은 표백을 방지하기 위해 완전히 어둡게 됩니다. 다음으로, 우리에 갇힌 화합물의 국부적 인 풍부를 중단하십시오.

그런 다음 두 광자 레이저의 강도를 증가시켜 SBFI의 효율적인 여기(excitation)를 가능하게 하고 UV 플래시를 적용하여 케이지 모니터 및 SBFI 형광의 변화를 초기화하고 체전류(somatic current)를 사용하여 SBFI 형광이 기준선으로 회복된 후 기록을 중지합니다. 모폴로지를 얻으려면 수행된 측정에 대해 설정된 클립 상자 영역의 XY, Z 스택을 기록합니다. 이 스택이 공간적으로 과도하게 샘플링되어 최적의 이미지 디콘볼루션을 가능하게 하고 이미지 품질과 해상도를 높일 수 있습니다.

패치 피펫을 통해 SBFI가 있는 뉴런을 로딩하면 케이지에 갇힌 글루타메이트로 국소 관류 후 다광자 여기를 사용하여 미세한 수상돌기와 인접한 척추를 포함한 전체 세포를 시각화할 수 있었습니다. UV 플래시를 수상돌기에 가깝게 적용하면 SBFI의 형광 방출이 일시적으로 감소하여 세포 내 나트륨 농도가 증가했음을 반영합니다. 동시에, 케이지 글루타메이트로 사전 관류되지 않은 슬라이스에 UV 플래시를 SOMA 적용시 내부 전류가 기록되었습니다.

SBFI 형광이나 내부 전류의 변화를 유도하지 않았으며, 이는 이러한 신호가 글루타메이트의 언케이징으로 인한 것임을 나타냅니다. 피크 진폭은 언케이징 스폿에 가까운 스파인에서 약간 더 높았던 반면, 추가 스파인에 대한 패턴은 부모 덴드라이트와 유사했습니다. 글루타메이트의 언시징에 대한 반응으로 수상돌기 및 가시로의 나트륨 유입 경로는 나트륨 투과성 이온성 글루타메이트 수용체, 글루타메이트 유도 세포 내 나트륨 신호에 대한 선택적 차단제를 사용하여 연구되었으며, 이러한 차단제의 존재 하에서는 유도된 체세포 전류가 생략되었습니다.

차단제가 씻겨 나가면 신호가 다시 회복되어 글루타메이트의 언케이징이 ca one 피라미드 뉴런의 세포친화성 글루타메이트 수용체를 활성화하여 세포 내 나트륨 일시적 및 내부 전류를 발생시킨다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 준비물의 손상을 최소화하기 위해 적외선 레이저에 대해 가능한 가장 낮은 강도를 선택하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 미세 잔해에서 나트륨 신호를 연구하기 위한 실험적 접근 방식의 중요한 단계를 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술을 마스터하면 다른 기술에 의해 도입된 것처럼 운동 아티팩트가 없는 온전한 조직에서 유발된 세포 내 이온 신호의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.