CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

이 절차의 전반적인 목표는 CRISPR Cas nine nuclease 시스템을 사용하여 게놈 결실을 생성하는 것입니다. 먼저 전기 정제, 두 개의 CRISPR 플라스미드와 GFP 리포터 플라스미드를 동시에 세포에 주입합니다. 그런 다음 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 GFP 발현 세포의 상위 3%를 분리합니다.

다음으로, 한계 희석에서 분류된 세포를 플레이트화하고 기존 PCR을 사용하여 bio allelic deletion 클론을 스크리닝합니다. 궁극적으로, CRISPR Cas nine은 기능 상실 삭제 대립유전자를 생성함으로써 유전자 및 유전 요소를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.단일 가이드 RNA에 의해 생성된 프레임시프트 돌연변이와 비교했을 때, CRISPR Cas nine nuclease 시스템에 의해 생성된 큰 결실은 기능 상실 돌연변이를 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 접근법은 또한 기존 PCR을 통해 쉽고 저렴한 스크리닝을 가능하게 합니다.

우리는 단일 가이드 RNA에 의해 생성된 작은 indels에 대한 스크리닝이 기술적으로 까다롭고 힘들며 비용이 많이 드는 결실 대립유전자가 비코팅 유전 요소 연구에 특히 유익하다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 각 CRISPR 쌍 펠릿에 대해 현탁액에서 성장한 6개의 세포에 10을 2배씩 넣습니다. 100마이크로리터의 전기천공법 용액에 세포를 재현탁시킨 다음 전기천공법 QAT로 옮깁니다.

CRISPR Cas nine 5마이크로그램, SG RNAA 5마이크로그램의 CRISPR Cas nine을 추가합니다. SG a B 및 GFP 발현 0.5 Microgram을 구축하고, 피펫을 상하로 여러 번 부드럽게 혼합하여 구성한다. electroporation 체계를 사용하여 거품을 생성하는 것을 피하십시오.

멸균 이송 피펫을 사용하여 2mm 베테에서 5밀리초 동안 250볼트로 셀을 전기 정화하고 용액을 1밀리리터의 예열 배양 배지로 즉시 옮깁니다. 세포를 섭씨 30도에서 24-72시간 동안 배양합니다. 멸균 50미크론 필터를 통해 세포를 팩스 튜브에 통과시킵니다.

그런 다음 팩스는 높은 수준의 플라스미드를 받은 세포를 농축하기 위해 GFP 양성 세포의 상위 3%를 분류합니다. 관심 세포에 대한 제한 희석 조건을 최적화한 후, 플레이트는 세포를 96웰 플레이트로 분류하고 웰당 100마이크로리터의 세포 배양 배지로 플레이트당 30개의 세포를 희석합니다. 나머지 분류된 벌크 셀의 경우 향후 도금을 위해 셀의 절반을 동결합니다.

스크리닝 및 프라이머 검증을 위해 나머지 절반을 플레이트합니다. 이러한 벌크 셀을 섭씨 37도에서 3일에서 7일 동안 배양합니다. 클론이 세포주의 배가 시간에 따라 7일에서 14일 동안 섭씨 37도에서 배양하도록 합니다.

게놈 DNA Resus를 분리하고 50 마이크로 리터의 DNA 추출 용액에서 부모 및 벌크 세포 펠릿을 현탁시키는 데 사용됩니다. 열순환기에서 샘플을 실행하여 게놈 DNA를 추출합니다. 그런 다음 DNA 농도를 측정합니다.

이제 10 마이크로 리터의 두 XPCR 혼합물을 결합하여 20 마이크로 리터 PCR 반응을 조립하십시오. 0.5 마이크로 리터의 10 마이크로 몰 전방 프라이머, 0.5 마이크로 리터의 10 마이크로 몰 역 프라이머, 50-100 나노 그램의 게놈 DNA 및 최대 20 마이크로 리터의 물. non deletion band와 deletion band에 대해 별도의 반응으로 PCR을 수행합니다.

다음으로, 샘플을 열 순환기에 넣고 함께 제공되는 서면 프로토콜에 자세히 설명된 대로 섭씨 60도의 A 무릎 꿇는 온도에서 35사이클을 사용하여 실행합니다. 하나의 XTAE 버퍼를 사용하여 센티미터당 10볼트에서 2%aros 겔의 샘플을 분해합니다. 그런 다음 샘플에서 non deletion 및 deletion bands의 존재 여부를 검사합니다.

단일 반응에서 deletion 및 non deletion PCR primer pair를 multiplex하는 전략을 고려하십시오. 또는 deletion 및 non deletion PCR 반응을 별도로 실행할 수 있습니다. 현탁 세포의 경우, 모든 클론을 웰당 이미 50마이크로리터의 세포 배양 배지를 함유하고 있는 단일 96웰 플레이트로 옮깁니다.

그런 다음 각 웰에서 50마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다. 대안적으로, 부착 세포의 경우, 트립신, 눈, 클론을 단일 96 웰 플레이트로 옮기기 전에 사용할 수 있습니다. 그런 다음 각 웰에서 50 마이크로 리터를 96 웰 PCR 플레이트로 옮기고 PCR 플레이트를 400 배 G에서 5 분 동안 원심 분리 한 다음 PCR 플레이트를 싱크대 위로 튕겨 상층액을 제거합니다.

이제 웰당 50마이크로리터의 DNA 추출 용액을 추가하고 게놈 DNA 추출이 PCR 반응을 실행하여 클론에서 비삭제 및 결실 밴드를 검출한 후 세포 펠릿을 재현탁합니다. 센티미터당 10볼트에서 2%aros 겔의 PCR 산물을 분해합니다. 하나의 XTAE 버퍼를 사용합니다.

원하는 결실이 있는 클론을 식별하고 더 큰 플레이트 또는 플라스크에서 배양물을 증폭합니다. 예시에서, 왼쪽에서 오른쪽으로 Parent Cells, 3개의 non deletion clones, 3개의 mono allelic deletion clones 및 3개의 bi allelic deletion clones를 관찰합니다. 다수의 비중첩 SG r NNA 쌍의 사용은 오프 타겟 효과를 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다.

각 쌍은 고유한 삭제의 생성으로 이어집니다. 유전자와 관련하여 다양한 위치에 있는 SG 쌍을 표적으로 하는 중단점을 사용하여 하나 또는 두 개의 대립유전자가 모두 삭제되지 않았거나 특정 동형의 파괴를 허용하더라도 전체 유전자체를 삭제하여 프레임시프트 인델을 생성할 수 있습니다. 이 실험에서.

전체 유전자의 결실과 관련하여, PIM 1, 2, SG RNA 쌍을 PX 3 3 0 발현 벡터에 클로닝하여 전기천공법을 통해 MEL 세포에 전달하도록 설계하였다. GFP 리포터와 함께, GFP 양성 세포의 상위 3%는 결실을 제한하여 클론으로 도금하고 이 PIM 1 결실에 대한 비결실 모노 대립유전자 및 바이오 대립유전자 결실 클론에 대해 PCR로 스크리닝했습니다. 생물 대립형질 결실 클론은 증식을 위해 5일을 허용한 후 추가 증식을 위해 선택되었습니다.

BIC 결실 및 결실을 확인하기 위해 각 클론을 게놈 DNA의 PCR로 재검사했습니다. Amplicon은 정확한 결실을 확인하기 위해 Sanger 염기서열분석을 받았습니다. RNA를 BIC deletion clones에서 분리하고 R-T-Q-P-C-R로 분석하여 PIM one 발현의 소실을 확인했습니다.

이 기술을 완전히 익히면 몇 주 안에 완료하여 바이탈릭 결실 클론을 식별할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 CRISPR CAS nine nuclease 시스템을 사용하여 CRISPR 플라스미드를 포어링하여 GFP 광도 세포를 분류하고 BioE 결실 클론에 대해 기존 PCR로 개별 클론을 스크리닝하여 게놈 결실을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.