2015년 1월 12일
이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 초파리 동공 눈 발달에 대한 라이브 이미징 동영상을 생성하는 효율적인 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 먼저 동공의 O perm을 제거하고 한쪽 눈의 신경 상피를 노출시키기 위해 측면을 따라 찢음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이미징 장비를 조립하고 번데기를 작은 바셀린 구슬에 장착하는 것입니다.
다음으로, 접착 벨트 영역에 있는 신경 상피의 연속 절편은 표준 형광 현미경을 사용하여 획득합니다. 마지막 단계는 표준 이미지 편집 소프트웨어에서 푸티지를 안정화하고 색상을 조정하는 것입니다. 궁극적으로, 초파리 신경 상피의 살아있는 세포 이미징은 패턴이 형성된 세포 행동을 밝히는 데 사용됩니다.
번데기는 이 단계에서 다소 연약하기 때문에 번데기를 부분적으로 해부한 다음 이미징 리그에 올바르게 장착하는 것이 까다로울 수 있으므로 이 방법의 눈 시각적 시연이 중요합니다. 또한 번데기의 올바른 방향과 눈 상피 위의 커버 슬립을 올바르게 배치하는 것은 성공적인 이미징을 위해 매우 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Mark Hellerman이 맡을 것입니다.
실험을 시작하려면 이전에 교차된 유전자형에서 흰색 pre puy를 선택하여 1.5ml 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 증류수에 적신 10cm 제곱 티슈 조각을 깨끗한 플라스틱 팁 상자에 넣습니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 팁 상자에 삽입합니다.
젖은 조직은 번데기의 건조를 방지하고 섭씨 25도에서 17-25시간 동안 배양합니다. 배양 후, 검은색 시가 해부 접시에 새로운 양면 테이프 조각을 놓습니다. 번데기의 등쪽을 위로 향하게 하여 테이프에 놓고 번데기의 흉부와 복부 부위를 접착하지 않고 번데기의 머리가 양면 테이프에 부착되어 있는지 확인합니다.
집게를 사용하여 A 펌을 조심스럽게 들어 올려 제거하여 동공 머리를 드러냅니다. 다음으로, 동공 케이스의 측면을 따라 찢습니다. 한쪽 눈 주변을 노출시키려면 접착 테이프에서 동공을 부드럽게 제거합니다.
압지로 15제곱밀리미터 크기의 작은 프레임을 만들고 가운데에 5mm 구멍을 뚫습니다. 프레임과 증류수를 담그고 현미경 중앙에 놓습니다. 30cc 주사기로 밉니다.
균일한 바셀린 링을 짜서 압지 프레임을 둘러쌉니다. 다음으로, 슬라이드에 작은 바셀린 구슬을 직접 추가합니다. 번데기를 조심스럽게 옆으로 눕히고 바셀린 비드로 지지합니다.
바셀리 링 위에 커버 슬립을 놓아 눈 위의 상피와 접촉하도록 합니다. 제제를 부드럽게 압축하여 커버 슬립을 바셀린에 밀봉하고 동공 눈 영역과 커버 슬립 이미지, 동공 제제 사이에 작고 평평한 접촉면을 생성합니다. 형광 현미경을 사용하여 7분마다 눈의 AAL 도메인, 부착 접합부 영역의 신경 상피를 통해 연속 절편을 캡처합니다.
적절한 디콘볼루션 소프트웨어를 사용하여 배경을 줄이고 각 Zack 파일 및 L-A-S-A-F 소프트웨어에 대한 직렬 섹션 이미지의 대비를 향상시킵니다. 도구 패널로 이동합니다. 3D 디콘볼루션을 선택하고 적용을 클릭합니다.
각 복잡한 스택 파일에 대해 최대 투영 또는 MP 이미지를 생성합니다. 각 MP 이미지를 정렬하여 개별 세포 거동을 강조하고 유기체 성장으로 인한 방해 요소를 줄입니다. 메인 메뉴의 파일 탭에서 Photoshop CS 5의 내장 알고리즘을 사용하여 스크립트를 열고 스택에 파일 로드를 선택합니다.
그런 다음 MP 이미지 파일을 로드 레이어 패널로 가져옵니다. 소스 이미지를 자동으로 정렬하려는 시도 옵션이 선택되어 있지 않은지 확인합니다. 그렇지 않으면 이미지 데이터가 왜곡될 수 있습니다.
모든 MP 파일이 레이어 창에 로드되면 모든 이미지가 시간순으로 되어 있고 가장 빠른 시점이 레이어 맨 위에 있는지 확인합니다. 올바르게 주문할 때까지 스택, 드래그 앤 드롭합니다. 필요한 경우 레이어 자동 정렬을 선택합니다.
위치 변경을 선택하고 확인을 클릭합니다. 초점이 맞지 않는 경우, 초기 MP 이미지의 영역은 초점이 맞춰진 망막 시야에서 균일하게 생성되도록 보정될 수 있습니다. 영상 처리를 시작하려면 LAS의 crop 함수를 사용하십시오.
Saf는 초기 및 최종 슬라이스를 수동으로 제한하므로 초기에 초점이 맞지 않는 영역 내의 접착 벨트에만 걸쳐 있습니다. 적용을 클릭하여 이 영역에 최적화된 새 스택 파일을 생성합니다. 그런 다음 로컬에 최적화된 스택에 대한 새로운 최대 투영을 생성하고 Photoshop에서 TIF 파일로 내보냅니다.
스크립트를 열고 스택에 파일 로드를 선택합니다. 그런 다음 초기 MP 파일과 최적화된 MP 파일을 로드 레이어 패널에 입력합니다. 다시 말하지만, 소스 이미지를 자동으로 정렬하려는 시도 옵션이 선택되어 있지 않은지 확인하고 확인을 선택합니다.
두 레이어를 모두 선택하고 자동 블렌드 레이어를 선택하여 균일하게 초점이 맞는 망막 필드를 생성합니다. 이 복합 이미지를 TIF 파일로 저장합니다. 변형 도구를 사용하여 망막의 배쪽 배쪽 축이 동영상 프레임의 Y축에 정렬되도록 이미지를 회전합니다.
개별 프레임의 레벨 조정을 사용하여 세포막과 세포체 사이의 대비를 향상시킵니다. 그런 다음 레이어에서 프레임 만들기를 선택하여 이미지를 동영상으로 변환합니다. 레이어는 스택의 맨 아래부터 순차적으로 애니메이션 창에 추가됩니다.
스택의 순서를 반전시키려면 모든 프레임을 선택한 다음 프레임 반전을 선택합니다. 각 프레임에 대해 0.8초의 프레임 지연 시간을 선택하고 QuickTime을 선택합니다. 내보내고 원하는 비디오 형식을 선택합니다.
마지막으로 렌더링 옵션에서 사용자 지정할 프레임 속도를 선택하고 프레임 속도를 15로 입력합니다. 그런 다음 렌더를 클릭합니다. 이 기법으로 눈 전체에 걸쳐 뚜렷한 발달 구배가 관찰되었으며, 이로 인해 눈 패턴에 대한 자세한 설명이 필요했습니다.
1차 랩핑(primary wrapping) 동안, 두 개의 세포가 1차(primaries)로 모집되었고, 이 세포들은 서로 연결되어 안정적인 연접(stable-connection)을 형성하기 위해 광수용체 다발을 빠르게 둘러쌌습니다. 분화되지 않은 intero 물질 세포는 원색이 싸이고 밀봉됨에 따라 무질서한 패턴으로 놓여 있습니다. 각 광수용체는 재조직된 국소 세포 움직임을 묶습니다.
inial cell은 각 oma의 등쪽과 복부 쪽에 그룹화되어 있습니다. Inter cell intercalation은 두 행에서 단일 행으로 셀을 재정렬했습니다. inter intercalation에 이어 3차 경쟁을 현미경으로 캡처했습니다.
경쟁하는 세포는 변위 전에 5분에서 10분 동안 3차 틈새를 차지했습니다. 결국, 단일 세포가 안정적인 3차 틈새 시장을 구축했습니다. 최종 가지치기(pruning) 과정에서 세포사멸(apoptosis)이 급증하여 겹안을 가로지르는 삽입 물질 세포 격자를 효율적으로 생성하는 데 필요한 최소 수준으로 ICS 수가 감소했습니다.
일단 숙달되면 올바르게 수행되면 PPE 이미징을 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 후속 이미지 처리에는 약 1시간이 걸립니다.
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이 프로토콜은 생체 드로소필라 번데기 눈 신경 상피를 이미지화하기 위한 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직 움직임과 불균일한 위상을 보상하여 여러 GFP 태그가 붙은 접합 단백질을 통해 세포 경계의 시각화를 향상시킵니다.
Live imaging of the Drosophila pupal eye enables direct observation of cellular dynamics during neuroepithelial patterning, providing a scalable model for de-risking target validation in developmental pathways. The method addresses tissue movement and topological variability, supporting reproducible quantitative analysis of cell behaviors critical for mechanistic studies in early discovery.
The workflow fits within the discovery biology phase, supporting hypothesis-driven investigation of cellular mechanisms prior to assay development and lead identification stages.