전의 VIVO 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

다음 실험의 전반적인 목표는 급성 축삭 변성 메커니즘을 실시간으로 평가하는 것입니다. 이는 허벅지 하나의 YFP 양성 신경 및 척수 조직을 분리하는 동시에 산소가 공급된 저칼슘, 인공 대뇌 척수액으로 조직을 지속적으로 관류함으로써 달성됩니다. 그런 다음 생리학적 조건을 유지하면서 2광자 현미경 대물렌즈 아래에서 척수 조직을 정렬하고 미엘린을 친유성 형광 염료 나일레드로 염색합니다.

다음으로, 기둥 내에서 수초화된 축삭을 횡단하기 위해 레이저 출력을 조정하여 등쪽 기둥의 등쪽 표면에 마이크로 크기의 병변을 만듭니다. 결과는 이미지의 정량적 측정을 기반으로 손상된 축삭돌기, 축삭주위 축삭돌기, 수초부 팽창 및 기타 세포 반응의 후퇴를 보여줍니다. 따라서 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 경추 척수 전체를 사용하기 때문에 등쪽 기둥 섬유가 손상되지 않은 상태로 유지된다는 것입니다.

따라서 이것은 백질 스트립 준비 중에 일반적으로 발생하는 기저의 중앙 수초화 섬유의 손상을 방지합니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Starlin ada가 될 것인데, 그는 심장 내 관류를 준비하기 위해 이 기술을 실제로 옹호했습니다. 저칼슘, 인공 대뇌 척수액 또는 A CSF를 2배 농축된 원료 BNC 솔루션으로 만들어 체외 척수를 풍부하게 만듭니다.

이미징하는 동안 유리병에 두 개의 스톡 용액 A와 B로 일반 A CSF를 준비합니다. pH 7.4에 대해 이러한 솔루션을 제공하십시오. 낮은 칼슘 A CSF는 해부 영역 근처에서 차갑게 유지하고 정상 A CSF는 현미경 근처의 실온에서 유지합니다.

사용하기 전에 30분 동안 자동차와 가스로 두 용액을 모두 거품을 일으키고 사용하는 동안 지속적으로 거품을 냅니다. 다음으로, 이미징을 위해 개방형 수조 관류 챔버를 준비합니다. 먼저 인라인 히터 금속 출력을 챔버에 연결합니다.

그런 다음 이미징 챔버의 위치를 약간 조정할 수 있도록 충분한 양의 끈적한 재료로 이미징 챔버를 유출 챔버에 부착합니다. 인라인 히터 피드백 온도 프로브를 유체 입구 근처에 고정하고 스테인리스강 흡입 튜브를 챔버 출구의 진공 라인에 고정합니다. 이제 진공 펌프와 관류 펌프를 켭니다.

챔버가 A CSF로 채워지면 펌프를 분당 1.5-2밀리리터로 낮춥니다. 그런 다음 진공 라인의 위치에 따라 챔버의 A CF 부피를 제어합니다. 6주에서 10주 된 TH one YFP 형질전환 마우스를 안락사시키기 위해.

먼저 반사적 발가락 꼬집음 반응이 없는지 확인합니다. 그런 다음 척수와 뇌를 덮고 있는 부위를 면도합니다. 면도 후 베타딘과 70% 에탄올로 노출된 피부를 닦아냅니다.

이제 가슴과 복부 부위에 70% 에탄올을 뿌리고 탄수화물 거품이 적은 칼슘 A CSF로 동물 트랜스 카디를 관류합니다. 간이 창백해지기 시작하면 클립으로 관류 바늘을 심장에 부착합니다. 그런 다음 동물을 뒤집어 70% 에탄올로 등 피부 쪽을 닦습니다.

코에서 엉덩이까지 정중선을 따라 절개하여 두개골 뚜껑과 척추 위의 조직을 노출시킵니다. 핀을 사용하여 피부를 옆으로 당겨 동물의 코와 엉덩이에 고정합니다. 이제 제제를 해부 현미경으로 옮기고 가위를 사용하여 후각 전구 수준에서 두개골의 등쪽 표면을 단단히 자릅니다.

새로 만든 절개 부위에 가위 끝을 삽입하고 양쪽 두개골 캡 가장자리를 따라 잘라 소뇌를 노출시킵니다. 두개골 뚜껑을 완전히 절제하지 마십시오. 뇌를 드러내는 두개골 뚜껑을 들어 올리고 소뇌 위의 두정골 사이의 왼쪽과 오른쪽 가장자리를 조심스럽게 자릅니다.

이제 두개골 뚜껑과 등쪽 척추 표면을 부드럽게 당기면서 척수를 더 노출시키기 위해 후방 신경근보다 약간 아래쪽 절단을 만듭니다. 그런 다음 끝이 가늘게 된 가위를 사용하여 척추뼈를 양옆으로 조심스럽게 자릅니다. 45도 각도에서는 등쪽 기둥이 손상되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

이 밝은 흰색 섬유는 조심하지 않으면 쉽게 손상되어 척추를 자르면서 절제 된 뼈와 근육을 부드럽게 잡아 당기는 작업을 계속합니다. 1-2cm를 잘라 영상에 적합한 경추 척수 조직의 일부를 분리합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 조직과 뼈를 척추와 평행하게 자릅니다.

또한 컬럼 아래의 조직을 청소하십시오. 이미징을 위해 조직이 챔버 높이에 평평하게 놓이는 것이 매우 중요하기 때문에 이러한 절단을 가능한 한 수평으로 만드십시오. 마지막으로, 숫자 11 메스를 사용하여 잔디 울루 섬유의 끝을 지나 상부 흉부 수준에서 뇌간을 횡단합니다.

그런 다음 가위를 사용하여 이 두 지점에서 조직과 뼈를 자릅니다. 분리된 조직은 척추의 2/3를 포함해야 하며, 척추 뼈대는 척추 뼈대(cordal brainstem), 경추 확대(cervical enlargement), 상부 흉추 척수(upper thoracic spinal cord)를 포함해야 합니다. 분리된 척추를 체외 이미징 챔버로 옮기고 다음 한 시간 동안 관류 8 온도를 섭씨 36도에서 37도 사이로 점차적으로 높입니다.

이미징하는 동안 이 온도를 유지하십시오. 이 프로토콜의 한 가지 중요한 측면은 등쪽 기둥 섬유를 손상시키지 않고 척수를 분리하는 것입니다. 이 프로토콜의 두 번째로 중요한 측면은 척수에 산소가 공급된 인공 뇌척수액이 지속적으로 관류되도록 하는 것입니다.

변형된 조직 슬라이드 홀더를 사용하여 챔버의 척추를 조심스럽게 고정합니다. 노출된 척수, 등쪽 기둥을 만지거나 같은 실 실로 압력을 가하지 않는 것이 중요합니다. 이제 수초를 염색하려면 용액 흐름을 잠시 중지하고 진공 라인을 제거하십시오.

5-10 마이크로 리터의 5 밀리 몰 나일 레드 염료를 척수의 코달 끝 근처에 추가합니다. 그런 다음 용액을 이미징 챔버 전체에 부드럽게 혼합하고 조직이 1-2분 동안 배양하도록 합니다. 염색이 완료되면 산소가 공급된 A CSF의 흐름을 분당 1.5에서 2밀리리터 사이로 되돌리고 두 개의 광 현미경을 사용하여 진공 라인을 교체합니다.

Water Immersion Objective를 사용하여 척수를 이미지화합니다. 대물렌즈를 A CSF 표면으로 천천히 내린 다음 AF 형광등 아래에서 척수에 초점을 맞춥니다. 이제 상승하는 풀의 기본 이미징을 위해 스캔 모드로 전환합니다.

오큘러스 수초 섬유. YFP 및 나일 레드를 자극하려면 여기를 950나노미터로 설정하고 DI 만성 및 벤드 패스 필터로 형광 방출을 분리합니다. 영상 촬영 후 한 시간 이내에 축삭돌기의 3% 이상이 스테로이드를 가지고 있다는 것을 알게 되면 이는 격리 중에 척수가 손상되었음을 의미합니다.

이제 레이저로 조직을 손상시키기 위해 제제를 버리는 것이 가장 좋습니다. 먼저, 조직에서 평평해 보이는 부위를 찾습니다. 그런 다음 보기 영역 배율을 30.3x로 높입니다.

레이저를 800나노미터로 조정하고 출력을 약 110밀리와트로 높입니다. 이제 5개의 시야각 레이저 스캔을 수행합니다. 결과는 20미크론 직경의 완전한 절제여야 합니다.

17밀리와트 및 20.08배 배율의 레이저를 사용하여 표준 이미징 설정에서 부상을 확인하십시오. 절제에서 축삭 섬유가 완전히 transection되지 않은 경우 제제를 폐기합니다. 이제 Z 캡처와 함께 타임랩스 설정을 사용하여 동적 부상 반응을 기록하십시오.

제제는 최대 24시간 동안 이미지화할 수 있습니다. 척수 분절은 기준선 T-P-L-S-M에 설명된 대로 분리되고 배치되었습니다. 기록은 수초화된 잔디 관절 색슨을 평행 정렬된 YFP 양성 축삭돌기로 보여주며, 축삭 스테로이드 또는 축삭 변성의 다른 형태학적 징후가 거의 없는 칼집 디나르 붉은색 염색 수초.

화살촉으로 강조된 ROM VA의 코와 같은 미세한 디테일을 볼 수 있습니다. 레이저로 인한 척수 손상 후 40분 후. transected 축삭의 대부분은 특징적인 축삭 말단구를 형성하고 부상 부위에서 후퇴하며, 부상 부위에 인접한 축삭돌기는 2차 변성을 겪고, 축삭 팽창이 더 두드러집니다.

분기별 수축 섬유와 달리, 병변과 스테로이드에서 원위부에 위치한 대부분의 수축 축삭 말구 구근에는 나일 레드로 강력하게 표시되어 축삭 내 환경 변화를 암시합니다. 7시간이 되자 축삭돌기는 병변 부위에서 계속 수축했습니다. 그러나 이것은 병변의 근위부 또는 근위부에 위치한 말구보다 병변에서 원위 또는 상부에 위치한 말구에서 더 분명합니다.

궁극적으로, 초기에 보존된 축삭돌기는 점차적으로 지연된 2차 변성을 겪었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경과 척수를 분리하고 레이저로 유도된 척수 손상을 수행하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 따라서 1차 및 2차 축삭 변성의 동적 측면을 실시간으로 검토할 수 있습니다.

이 모델 시스템을 사용하여 얻은 정보는 손상 후 축삭과 수초 손상에 대한 중요한 기계론적 이해로 이어질 수 있습니다.