Name: 요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 요오드 산 쉬프 염색법을 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 시각화하는 방법을. 밀도 구배 원심분리로 세포를 분리하고 현미경으로 대사 상태를 분석할 수 있습니다.

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이 연구는 NSERC Discovery 프로그램 보조금 번호 RGPIN 418522-2013의 보조금으로 지원되었습니다. 유익한 토론을 해주신 R. Kilgour님께 감사드리며, 마우스 근육 절편을 제공해 주신 Katelin Gresty님과 A. Berghdal 박사님께 감사드립니다.

인간의 혈액 샘플을 연구 콩 코디 아 대학 윤리 심의위원회, 인증서 번호 10000618.에 의해 콩 코디 아 대학 윤리 심의위원회, 인증서 번호 2010BERG에 의해 승인 된 마우스 근육에 작업을 승인했다. 전혈 1. PBMC 분리 참고 : 멸균 기술과 제조 소독 장비를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서이 절차를 수행합니다. <ol><li> 조심스럽게 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 헤파린 (항 응집제) 혈액 수집 튜브에서 전혈 10-15 mL에 붓는다. 작은 혈액 유출시 청소 조직을 사용 DDH 2 O 70 % EtOH로 닦아냅니다. </li><li> 인산 버퍼 식염수 (PBS 1X) pH가 7.4 : 1의 비율로 1 원뿔 튜브에 혈액을 희석. 최대 총 용량은 30 ml를 초과하지 않는지 확인합니다. </li><li> 부드럽게 거품을 방지 혈청 학적 피펫 총을 사용하여 섞는다. 주 : 혈액을 방지하기 위해 튜브를 반전 혼합하지 마십시오원심 분리 동안 모자 및 후속 누출에 ccumulation. </li><li> 새로운 50 ㎖ 용량 원뿔 관에, 피콜 - 페이크 13 ml에 (재료 및 장비 표 참조)를 추가합니다. 랙에 튜브를 수직으로 유지합니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여, 희석 된 혈액을 상단에있는 튜브의 내부 벽에 전송 피펫 팁을 터치합니다. 느리고 일정한 압력으로 자당 층의 상부에 혈액 층을 형성하는 튜브의 내부 벽을 따라 혈액 옮긴다. 모든 혈액이 전송 될 때까지이 단계를 여러 번 수행합니다. </li><li> 단단히 튜브 씌우고 5 매체 가속도 세트로 스윙 로터 700 XG에 실온에서 30 분 동안 튜브를 원심 분리하고, 감속은 제로로 설정. </li><li> 천천히 튜브를 꺼내 레이어를 방해하지 않고, 바이오 안전성 캐비닛에 다시 걸릴. </li><li> 조심스럽게 PBS / 플라즈마 사이에 배치 된 PBMC이있는 버피 코트 (얇은 흐린 흰색 층), 수집차 피콜 층은 전송 피펫을 사용하여. 자당 층 수집 피하고 적혈구 층을 방해하지 않는다. </li><li> 새로운 50 ml의 멸균 원뿔 관에 버피 코트를 전송합니다. 그것은 모든 PBMC를 수집하는 단계 1.8을 반복 여러 번 걸릴 수 있습니다. </li><li> PBMC와 튜브에 PBS 산도 7.4을 추가하고 45 ml의 표시로 채워. 철저하게 튜브를 흔들어. 소용돌이하지 마십시오. </li><li> 워시 1 : 원심 분리기에서 15 분 동안 원추형 튜브의 하단의 한 PBMC 펠릿의 형성을 관찰 (9)에 설정된 최대 가속 및 감속 모두 480 XG에. </li><li> 표백제 10 ㎖와 플라스틱 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오. </li><li> 부드럽게 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대해 &quot;랙&quot;에 의해 세포 펠렛을 풉니 다. 소용돌이하지 마십시오. </li><li> 튜브에 신선한 PBS 산도 7.4의 25 ML을 추가합니다. 하나 이상의 튜브가 처리되는 경우,이 단계에서 함께 펠렛을 풀링. </li><li> 2 세척 : 원심 분리기에게 튜브를 12 분 동안 480 XG 위스콘신(9)에 설정된 최대 가속 및 감속 모두 토륨. </li><li> 표백제의 스플래시와 플라스틱 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오. </li><li> 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대한 조심스럽게 &quot;랙&quot;. 소용돌이하지 마십시오. </li><li> 튜브에 신선한 PBS의 25 ML을 추가합니다. <ol><li> 세포의 50 μl를 꺼내 생존 수에 대한 microcentrifuge 관에 전송합니다. </li><li> 트리 판 블루 (생존 얼룩)와 피펫 최대의 동일한 양 (50 μl를) 추가하고 아래로 부드럽게 혼합. </li></ol></li><li> 10 μl를 꺼내 1 ㎖ 당 세포의 생존 능력을 확인하기 위해 혈구로 전송. 세포 / ml의 수를 기록한다. </li><li> 세포의 원하는 금액을 가지고 9로 설정 최대 가속 및 감속 모두 480 XG에 12 분 동안 튜브를 원심 분리기. </li><li> 표백제와 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오. </li><li> 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대한 조심스럽게 &quot;랙&quot;. 8 추가튜브에 PBS의 0 μL. </li></ol> 2. PBMC 슬라이드 만들기 <ol><li> 현미경 슬라이드에 세포의 80 μl를 놓습니다. 다른 슬라이드의 도움으로 드롭 얼룩이나 슬라이드의 양쪽 끝에서 40 ㎕를 각 2 방울을 배치합니다. </li><li> 건조 할 수있는 생물 안전 캐비닛에 슬라이드를 둡니다. 프로스트 측에 연필로 슬라이드 레이블. </li></ol> 3. 슬라이드에 샘플을 고정 <ol><li> 4.5 ml의 99 % 에탄올 37 % 포름 알데히드 0.5 ㎖를 혼합하여 정착 솔루션을 준비합니다. </li><li> 슬라이드가 건조 된 후, 갓 정착액 용액 2 ㎖를 꺼내 슬라이드의 전체 표면이 피복되도록 슬라이드에 붓는다. </li><li> 1 분 동안 슬라이드에 솔루션을 남겨주세요. 수돗물로 1 분 동안 슬라이드를 씻어 공기 건조에 둡니다. </li></ol> 4. 음성 대조군의 아밀라아제 솔루션 만들기 <ol><li> 아밀라아제 분말 0.25 g을 디 50ml에 용해잠잠 물. 깨끗한 100 비이커에 용액을 붓고. </li><li> 슬라이드의 절반이 치료를 수신하고, 다른 절반은 미처리 유지 한 후, 실온 (도 1C)에서 15 분 동안 인큐베이션 비이커에 슬라이드 젖어. </li><li> 슬라이드의 측면 아밀라아제 치료를 받고있는 메모를합니다. 치료 및 제어 사이의 경계를 나타내는 슬라이드 뒷면에 선을 그립니다. </li><li> 아밀라아제 용액을 제거하고 공기 건조에 슬라이드를 떠나 DDH 2 O와 함께 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol> 5. 요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 및 이미지를 수행 주 : PAS는 시약 흡입 독성 및 부식성, 그래서 단계 화학 퓸 후드에서 수행해야하고, 노폐물을 적절히 기관 가이드 라인에 따라 처리되어야한다. <ol><li> 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 샘플에 정기 산 용액의 1.50-2.00 ml에 붓는다. Incuba실온에서 5 분 동안 TE. </li><li> 증류수의 여러 비용이 슬라이드를 씻어. </li><li> 슬라이드에 쉬프의 시약의 1.50-2.00 ml에 붓고 실온에서 15 분 동안 그것을 품어. </li><li> 5 분 동안 증류수로 슬라이드를 세척하고 건조 공기에 둡니다. </li><li> 슬라이드에 10 μl의 설치 미디어를 적용하고 두 개의 작은 된 커버 커버, 또는 50 μl를 적용하고 하나의 큰 커버 슬립을 사용합니다. </li><li> 커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 적용, 건조 하룻밤을 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 100X 목표를 사용하여 쌍안 광학 현미경으로 이미지를 가져옵니다

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이 비디오 문서의 중요한 단계는 세포의 세척 및 아밀라아제 치료 중이었다. 슬라이드를 세척하는 동안, 키 단계는 플라스틱 짤 세척 병을 사용하고 물이 부드럽게 슬라이드에 샘플을 통해 실행시키는 및 샘플에 직접 목표로하지 않았다. 조금이라도 물을 직접 압력은 슬라이드를 나서야 세포를 일으킬 것입니다. 또 다른 중요한 단계는 ± 아밀라아제 조건에 대해 동일한 슬라이드를 사용하는 것이 었습니다. PBMC를 상기 슬라이드에 부착 된 후에, 슬라이드는 신중히 스미어의 절반 만이 아밀라제 용액에 노출시켰다 비이커에 넣었다. 혈액 세포가 동일한 슬라이드에서 때문에이 단계 따라서 약간의 타이밍 변화로 인해 발생할 수있는 교란 변수를 최소화 강력한 제어를 제공한다. 세포 치료 없이도 잘 붙어 있으므로, 예를 들면 폴리 -L- 리신 또는 폴리에틸렌 글리콜 코팅과 관련된 추가 비용 및 시간이 보장되지 않을 것이다. TR을 통해아밀라아제의 최적 활성을 oubleshooting 것이 결정되었다. 근...

요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 널리 근육 연구 및 진단에 사용되는 면역 조직 화학 기술이다. 또한, 혈액 샘플에 대한 진단 도구로서 이용된다. 기술은 무색 쉬프 시약함으로써 진한 색 마젠타 생성물을 생산하는 반응 생성 다당류 알데히드기 유닛 내에 샘플을 산화에 요오드 산 용액을 적용하여 작동한다. 이 절차의 단계는 그림 1에 나타내었다. 얼룩은 글리코겐, 당 단백질, 당지질, 점액, 또는 다당류 부분과 다른 분자를 포함하는 다당류 마젠타, 아무것도를 켭니다. PAS 염색 종종 근육 섬유의 글리코겐 수준을 측정하기 위해 사용된다. 근육 조직 섹션은 단단히 슬라이드에 부착하고 여러 세척 및 염색 단계를 견딜로 기술에 이상적이다. 글리코겐은 높은 수요가 유형 II 근육 섬유, 빠른 트 위치에서 가장 존재최대 성능 1,2 글리코겐을 필요로하는 빠른 ATP 생산을위한. 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제 효소의 작용을 통해 무료 포도당으로 분해 될 수있는 포도당의 분 지형 중합체이다. 휴식과 영양 자족의 시대에, 글리코겐, glycogenesis의 과정을 통해 보충하는 동안 영양 부족 또는 고 에너지 수요의 시대; 글리코겐은 글리코겐 분해에 의해 포도당으로 분해된다. 혈액 샘플에 이른 1950의 임상의 과학자들이 탐험으로 PAS 염색에서 각종 질병 3-7 글리코겐 함량을 분석합니다. 예를 들어, 폼 페병 질환-진실한 글리코겐 저장 질환 -에 백혈구 건강한 대조군 (8)로부터 크게 다르다 글리코겐 대량 축적된다. 이 비디오 문서에는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 건강한 피험자에서의 정맥혈 샘플에 대한 사용 PAS 염색 적응 버전을 보여준다. PBMCS는 자연 살해 세포 및 단핵구와 같은 T 림프구와 B 림프구 가정뿐만 아니라 다른 면역 세포 림프구를 주로 함유한다. 제 정제 단계는 적혈구, 호중구 및 다른 과립구를 제거한다. 이 기술은 전체 혈액 도말하여 PAS에 비하여 양성 세포보다 강력한 열거 허용 림프구의 농축 비율에 데이터를 제공한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52199/52199fig1highres.jpg"> 도 1 :. PBMC에 PAS 염색 단계 방법에 의해 단계 (A) 우선, PBMC 단리는 피콜 구배 통해 이루어진다는, 왼쪽 패널 원심 분리 전에 제제를 도시 오른쪽 패널은 원심 분리 후를 도시 PBMC를 포함하는 버피 코트 관의 중심에서 관찰된다. (B)가 격리 된 PBMC 포르말린 - 에탄올 고착성을 사용 솔루 슬라이드에 고정되고기. 슬라이드 부드럽게 세척 플라스틱 병에서 증류수로 세정한다. (C)는 슬라이드 글리코겐 용해 아밀라제 용액으로 채워진 100 ㎖ 비이커 반쯤에 배치된다. 슬라이드 부드럽게 세정한다. (D)는 슬라이드 당류의 산화가 일어나는 요오드 산 용액으로 처리한다. 슬라이드 부드럽게 씻어 준다; 이는 과량의과 요오드 산을 제거하고 산화 공정을 중지한다. (E)을 쉬프 시약이 슬라이드에 첨가 될 때, 산화 단계 동안 만들어 알데히드와 반응 할 것이다. 이 무색 시약은 깊은 붉은 마젠타 제품에서 발생합니다. 슬라이드는 부드럽게 초과 쉬프 시약을 제거하기 위해 세척한다.

<table><tbody><tr><td>Periodic Acid Shiff Kit</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>395B</td><td>사용 전 상온으로 맞추십시오. 본 키트의 물질은 독성이 있으며 유해합니다. 주의하여 사용하십시오.</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylase from porcine pancreas</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A3176</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 현미경</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Axio Lab A0</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Assay Kit</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>MAK016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td><a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR, GE Healthcare</a></td><td>17-1440-02</td><td>비이온성 합성 자당 폴리머.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td>PBMC 분리를 위해 스윙 버킷 로터를 사용하였습니다.</td></tr></tbody></table>

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

PAS(Periodic acid Schiff) 염색은 근육 생검 및 혈액 샘플의 진단 도구로 사용되는 면역조직화학 기술입니다. 글리코겐(glycogen), 당단백질(glycoprotein), 당지질(glycolipids)과 같은 다당류는 밝은 자홍색으로 염색되어 조직 내 양성 세포와 음성 세포를 쉽게 열거할 수 있습니다. 근육 세포에서 PAS 염색은 다양한 유형의 근육 세포에서 글리코겐 함량을 측정하는 데 사용되며, 혈액 세포 샘플에서 PAS 염색은 다양한 상태에 대한 진단 도구로 연구되었습니다. 혈액에는 면역 체계에 속하는 백혈구의 비율이 포함되어 있습니다. 면역 체계의 세포가 글리코겐을 가지고 이를 에너지원으로 사용한다는 개념은 널리 연구되지 않았습니다. 여기에서는 인간 정맥혈의 말초 혈액 단핵 면역 세포에 적용할 수 있는 PAS 염색 프로토콜의 수정된 버전에 대해 설명합니다. PAS 양성 과립을 가진 작은 세포와 확산성 PAS 염색을 가진 더 큰 세포가 관찰되었습니다. 아밀라아제로 샘플을 처리하면 이러한 패턴이 제거되어 염색의 특이성을 확인할 수 있습니다. 효소 분해를 기반으로 한 대체 기술은 샘플에 글리코겐의 존재와 양을 확인했습니다. 이 프로토콜은 혈액 유래 림프구의 다당류 함량을 연구하는 혈액학자 또는 면역학자에게 유용합니다.

시약 및 기본 기술의 유효성을 검증하기 위해, PAS 염색 마우스 가자미근 섹션에 제조업체의 지침에 따라 수행 하였다. 염색은 제물로 같은 날에 이루어졌다과 염색의 마지막 단계에서, 섹션 자일 렌에 의해 수정되었습니다. 가자미근은 ~ 35 % 글리코겐 양성 세포 구를 포함하는 것으로 알려져있다. 근육 세포 염색은 세포 내에서 두 개의 별개 PAS 양성 특징 - 점상 과립을 표시하고, 세포막 (도 2A)를 demarking 실선. 점상 과립의 존재는 글리코겐과 일치하고, 긍정적 인 근육 세포를 정의하는 데 사용 하였다. 아밀라아제와 샘플의 치료는 그들을 글리코겐 (그림 2B)을 인과 일치하는 점 모양의 입자를 제거했습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52199/52199fig2highres....

주기적 산 쉬프 염색은 조직의 다당류 함량을 시각화하는 기술입니다. 이 기사는 인간 정맥혈에서 정제된 말초 혈액 단핵 세포에 사용하도록 조정된 주기적인 산 Schiff 염색 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 샘플은 림프구와 면역 체계의 다른 백혈구를 위해 풍부합니다.

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

이 절차의 전반적인 목표는 말초 혈액 단핵 세포의 글리코겐 함량을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간 전혈에서 P BMC를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 혈액 세포를 도포하거나 피펫팅하여 샘플 슬라이드를 준비한 다음 고정 용액으로 처리한 다음 음성 대조군을 위해 세척하는 것입니다.슬라이드의 절반을 아밀라아제 용액에 담그면 글리코겐 폴리머가 용해되고 세척됩니다. 이제 샘플을 주기적인 산성 용액으로 염색한 다음 세척합니다. 마지막 단계는 교대조의 시약을 추가한 후 세척하는 것입니다.궁극적으로 광학 현미경은 세포 내부에 저장된 글리코겐을 보여주는 데 사용됩니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전혈 염색에 비해 슬라이드당 단핵 세포가 더 많다는 것입니다. 따라서 글리코겐 함량과 림프구를 분석하는 것이 더 효율적인데, 호중구와 적혈구가 없기 때문이다.생물 안전 캐비닛에서 이 절차를 시작하려면 헤파린화된 채혈 튜브에서 10-15밀리리터의 전혈을 50밀리리터의 멸균 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, pH 7.4에서 PBS one X의 혈액을 1:1의 비율로 희석하고 최대 총 부피가 30ml를 초과하지 않도록 합니다. 혈청 학적 피펫 건을 사용하여 부드럽게 혼합하고 거품이 발생하지 않도록하십시오.그런 다음 13 밀리리터의 비이온 성 합성 중합체 자당, FICO를 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 FICO 층 위에 혈액층을 형성하기 위해 희석된 혈액을 느리고 일정한 압력으로 첨가합니다. 모든 혈액이 전달될 때까지 이 단계를 여러 번 수행합니다.그 후, 튜브를 단단히 캡을 씌우고 실온에서 30분 동안 400Gs.그 후 천천히 튜브를 꺼내 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다. 다음으로, pbmc가 위치한 PBS 혈장과 FICO 층 사이의 버피 코트를 조심스럽게 수집합니다. FICO 층을 모으지 말고 적혈구층을 방해하지 마십시오.그런 다음 버피 코트를 새로운 50ml 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다. P BMC가 있는 튜브에 PBS를 추가하고 45ml 표시까지 채웁니다. 그런 다음 튜브를 완전히 흔듭니다.그런 다음 15분 동안 원심분리합니다. 277g에서 p BMC의 팔레트가 원뿔형 튜브의 바닥에 형성됩니다. 그 후, 상층액을 10ml의 표백제가 든 플라스틱 비커에 버립니다.물결 모양의 표면에 튜브를 부드럽게 올려 세포 펠릿을 느슨하게 합니다. 튜브에 20ml의 새 PBS를 추가합니다. 하나 이상의 튜브를 처리하는 경우 이 단계에서 펠릿을 함께 당깁니다.다음으로, 튜브를 480gs에서 12분 동안 원심분리합니다. 표백제를 뿌린 플라스틱 비커에 상등액을 버리십시오. 그런 다음 물결 모양의 표면에 튜브를 부드럽게 올려 놓습니다.그 후에 다시 튜브에 25ml의 새 PBS를 추가합니다. 50마이크로리터의 세포를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 생존 가능성을 위해 count를 사용하여 세포를 계산합니다.50마이크로리터의 트리안 블루와 피펫을 위아래로 부드럽게 넣어 섞습니다. 그 후, 혼합물 10 마이크로 리터를 혈구 분석기로 옮깁니다. 세포의 생존 능력을 확인하고 밀리리터당 세포 수를 기록합니다.원하는 양의 세포를 취하고 177g에서 12분 동안 튜브를 원심분리합니다. 그 후 SUP natant를 표백제와 함께 비커에 버립니다. 그런 다음 물결 모양의 표면에 튜브를 부드럽게 끼운 다음 80마이크로리터의 PBS를 튜브에 추가합니다.PBMC 슬라이드를 만들려면 80마이크로리터의 세포를 사전 라벨링된 현미경 슬라이드에 놓고, 다른 슬라이드를 사용하여 방울을 바르거나, 슬라이드의 양쪽 끝에 40마이크로리터 방울 두 방울을 놓습니다. 생물 안전 캐비닛의 슬라이드를 건조시키십시오. 그런 다음 0.5 밀리리터의 37 % 포름 알데히드와 4.5 밀리리터의 99 % 에탄올을 혼합하여 정착 용액을 준비합니다.슬라이드가 건조된 후 슬라이드에 갓 만든 고정액 2ml를 추가하여 전체 표면을 덮습니다. 용액을 슬라이드에 1분 동안 그대로 두었다가 수돗물로 1분 더 헹굽니다. 그런 다음 자연 건조시키십시오.이제 용해하십시오. 증류수 25ml에 아밀라아제 분말 50g을 넣습니다. 용액을 100ml 비커에 붓습니다.다음으로, 슬라이드의 절반을 비커에 담그고 15분 동안 배양합니다. 실온에서는 아밀라아제 치료를 받는 쪽을 메모해 둡니다. 슬라이드 뒷면에 치료와 통제 사이의 경계를 나타내는 선을 그립니다.그 후 슬라이드를 증류수로 세척하여 아밀라아제 용액을 제거합니다. 그런 다음 슬라이드를 자연 건조된 상태로 두십시오.이 단계에서는 슬라이드를 평평한 표면에 놓습니다. 샘플에 2ml의 주기적 산성 용액을 바르고 실온에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 증류수로 슬라이드를 여러 번 헹굽니다. 슬라이드에 2ml의 교대 시약을 바르고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 증류수로 슬라이드를 5분 동안 세척한 다음 자연 건조시킵니다.다음으로, 슬라이드에 100마이크로리터 장착 매체를 적용하고 하나의 큰 커버 슬립으로 덮거나 50마이크로리터를 적용하고 두 개의 작은 커버 슬립을 사용합니다. 그런 다음 커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 바르십시오. 밤새 말리십시오.그런 다음 100 x 대물렌즈 PAS를 사용하여 양안 광학 현미경으로 이미지를 얻습니다. 염색은 건강한 피험자의 정맥혈에서 P BMC에 대해 수행되었습니다. PAS 염색된 P BMC는 다양한 염색 패턴을 보였습니다.과립이 있는 작은 세포가 쉽게 관찰되었습니다. 확산된 염색 패턴을 가진 더 큰 세포의 비율도 관찰되었습니다. 아밀라아제(amylase)로 샘플을 처리하면 과립 신호가 제거되고 확산된 PAS 양성이 감소되었습니다.PAS와 HEMATIN 염색은 전혈 슬라이드에서 수행되었습니다. 이 PBMC는 많은 적혈구로 둘러싸여 있습니다. 98%의 PAS 양성 pbmC는 더 작은 세포였고, 40%는 더 큰 세포였습니다.아밀라아제 처리는 작은 세포에서 PAS 신호를 제거하고 큰 세포에서 PAS 신호를 7%로 크게 감소시켰습니다.PAS 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 화학 후드를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 in vitro에서 말초 혈액 단핵 세포의 글리코겐 수치를 평가하기 위한 주기적인 산-Schiff 염색 기술을 보여줍니다. 이 염색은 세포 내 글리코겐 과립에 자홍색을 부여하여 현미경으로 볼 수 있도록 합니다.

세포의 주기적 산-쉬프 염색: 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐 수치를 감지하는 시험관 기술

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