요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

주기적 산 쉬프 염색은 조직의 다당류 함량을 시각화하는 기술입니다. 이 기사는 인간 정맥혈에서 정제된 말초 혈액 단핵 세포에 사용하도록 조정된 주기적인 산 Schiff 염색 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 샘플은 림프구와 면역 체계의 다른 백혈구를 위해 풍부합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 말초 혈액 단핵 세포의 글리코겐 함량을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간 전혈에서 P BMC를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 혈액 세포를 도포하거나 피펫팅하여 샘플 슬라이드를 준비한 다음 고정 용액으로 처리한 다음 음성 대조군을 위해 세척

슬라이드의 절반을 아밀라아제 용액에 담그면 글리코겐 폴리머가 용해되고 세척됩니다. 이제 샘플을 주기적인 산성 용액으로 염색한 다음 세척합니다. 마지막 단계는 교대조의 시약을 추가한 후 세척하는 것입니다.

궁극적으로 광학 현미경은 세포 내부에 저장된 글리코겐을 보여주는 데 사용됩니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전혈 염색에 비해 슬라이드당 단핵 세포가 더 많다는 것입니다. 따라서 글리코겐 함량과 림프구를 분석하는 것이 더 효율적인데, 호중구와 적혈구가 없기 때문이다.

생물 안전 캐비닛에서 이 절차를 시작하려면 헤파린화된 채혈 튜브에서 10-15밀리리터의 전혈을 50밀리리터의 멸균 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, pH 7.4에서 PBS one X의 혈액을 1:1의 비율로 희석하고 최대 총 부피가 30ml를 초과하지 않도록 합니다. 혈청 학적 피펫 건을 사용하여 부드럽게 혼합하고 거품이 발생하지 않도록하십시오.

그런 다음 13 밀리리터의 비이온 성 합성 중합체 자당, FICO를 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 FICO 층 위에 혈액층을 형성하기 위해 희석된 혈액을 느리고 일정한 압력으로 첨가합니다. 모든 혈액이 전달될 때까지 이 단계를 여러 번 수행합니다.

그 후, 튜브를 단단히 캡을 씌우고 실온에서 30분 동안 400Gs.그 후 천천히 튜브를 꺼내 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다. 다음으로, pbmc가 위치한 PBS 혈장과 FICO 층 사이의 버피 코트를 조심스럽게 수집합니다. FICO 층을 모으지 말고 적혈구층을 방해하지 마십시오.

그런 다음 버피 코트를 새로운 50ml 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다. P BMC가 있는 튜브에 PBS를 추가하고 45ml 표시까지 채웁니다. 그런 다음 튜브를 완전히 흔듭니다.

그런 다음 15분 동안 원심분리합니다. 277g에서 p BMC의 팔레트가 원뿔형 튜브의 바닥에 형성됩니다. 그 후, 상층액을 10ml의 표백제가 든 플라스틱 비커에 버립니다.

물결 모양의 표면에 튜브를 부드럽게 올려 세포 펠릿을 느슨하게 합니다. 튜브에 20ml의 새 PBS를 추가합니다. 하나 이상의 튜브를 처리하는 경우 이 단계에서 펠릿을 함께 당깁니다.

다음으로, 튜브를 480gs에서 12분 동안 원심분리합니다. 표백제를 뿌린 플라스틱 비커에 상등액을 버리십시오. 그런 다음 물결 모양의 표면에 튜브를 부드럽게 올려 놓습니다.

그 후에 다시 튜브에 25ml의 새 PBS를 추가합니다. 50마이크로리터의 세포를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 생존 가능성을 위해 count를 사용하여 세포를 계산합니다.

50마이크로리터의 트리안 블루와 피펫을 위아래로 부드럽게 넣어 섞습니다. 그 후, 혼합물 10 마이크로 리터를 혈구 분석기로 옮깁니다. 세포의 생존 능력을 확인하고 밀리리터당 세포 수를 기록합니다.

원하는 양의 세포를 취하고 177g에서 12분 동안 튜브를 원심분리합니다. 그 후 SUP natant를 표백제와 함께 비커에 버립니다. 그런 다음 물결 모양의 표면에 튜브를 부드럽게 끼운 다음 80마이크로리터의 PBS를 튜브에 추가합니다.

PBMC 슬라이드를 만들려면 80마이크로리터의 세포를 사전 라벨링된 현미경 슬라이드에 놓고, 다른 슬라이드를 사용하여 방울을 바르거나, 슬라이드의 양쪽 끝에 40마이크로리터 방울 두 방울을 놓습니다. 생물 안전 캐비닛의 슬라이드를 건조시키십시오. 그런 다음 0.5 밀리리터의 37 % 포름 알데히드와 4.5 밀리리터의 99 % 에탄올을 혼합하여 정착 용액을 준비합니다.

슬라이드가 건조된 후 슬라이드에 갓 만든 고정액 2ml를 추가하여 전체 표면을 덮습니다. 용액을 슬라이드에 1분 동안 그대로 두었다가 수돗물로 1분 더 헹굽니다. 그런 다음 자연 건조시키십시오.

이제 용해하십시오. 증류수 25ml에 아밀라아제 분말 50g을 넣습니다. 용액을 100ml 비커에 붓습니다.

다음으로, 슬라이드의 절반을 비커에 담그고 15분 동안 배양합니다. 실온에서는 아밀라아제 치료를 받는 쪽을 메모해 둡니다. 슬라이드 뒷면에 치료와 통제 사이의 경계를 나타내는 선을 그립니다.

그 후 슬라이드를 증류수로 세척하여 아밀라아제 용액을 제거합니다. 그런 다음 슬라이드를 자연 건조된 상태로 두십시오.이 단계에서는 슬라이드를 평평한 표면에 놓습니다. 샘플에 2ml의 주기적 산성 용액을 바르고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 증류수로 슬라이드를 여러 번 헹굽니다. 슬라이드에 2ml의 교대 시약을 바르고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 증류수로 슬라이드를 5분 동안 세척한 다음 자연 건조시킵니다.

다음으로, 슬라이드에 100마이크로리터 장착 매체를 적용하고 하나의 큰 커버 슬립으로 덮거나 50마이크로리터를 적용하고 두 개의 작은 커버 슬립을 사용합니다. 그런 다음 커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 바르십시오. 밤새 말리십시오.

그런 다음 100 x 대물렌즈 PAS를 사용하여 양안 광학 현미경으로 이미지를 얻습니다. 염색은 건강한 피험자의 정맥혈에서 P BMC에 대해 수행되었습니다. PAS 염색된 P BMC는 다양한 염색 패턴을 보였습니다.

과립이 있는 작은 세포가 쉽게 관찰되었습니다. 확산된 염색 패턴을 가진 더 큰 세포의 비율도 관찰되었습니다. 아밀라아제(amylase)로 샘플을 처리하면 과립 신호가 제거되고 확산된 PAS 양성이 감소되었습니다.

PAS와 HEMATIN 염색은 전혈 슬라이드에서 수행되었습니다. 이 PBMC는 많은 적혈구로 둘러싸여 있습니다. 98%의 PAS 양성 pbmC는 더 작은 세포였고, 40%는 더 큰 세포였습니다.

아밀라아제 처리는 작은 세포에서 PAS 신호를 제거하고 큰 세포에서 PAS 신호를 7%로 크게 감소시켰습니다.PAS 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 화학 후드를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.