문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

이 절차의 전반적인 목표는 신생아 난소 및/또는 개별 난포를 체외에서 성장시키는 것입니다. 이것은 먼저 적절한 나이의 차가운 암컷의 난소를 절개함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 침술로 개별 난포를 미세 절개하는 것을 포함하여 조직을 준비하는 것입니다.

그런 다음 신생아 난소 또는 개별 전전 여포를 규칙적인 수유로 배양하고 마지막 단계는 조직학적 또는 분자 분석을 위해 조직을 고정하거나 동결하는 것입니다. 궁극적으로, 배양 시스템은 고도의 생리학적 방식으로 발달을 지원하며 난포 발달 조절을 검사하고 원시 난포와 성장하는 난포 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 난포 여포가 여포 발달을 통해 지지되어 기질을 지지할 필요 없이 3차원 구조를 유지한다는 것입니다.

이 방법은 난소 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 화학 요법, 난소에 대한 약물과 같은 독성 화합물의 영향 및 그에 따른 여성 생식력을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 먼저 다양한 연령과 난포의 단계를 공동 배양하는 것에 대한 아이디어를 가지고 있었는데, 성장하는 여포가 휴지기의 원시 여포 풀에 미치는 영향을 조사하는 방법을 논의할 때 Steph Morgan 및 Lisa Campbell과 함께 이 기술을 시연할 것은 실험실의 기술자인 Vivian Allison과 수년 동안 실험실에서 박사 후 연구원이었던 Allison Murray입니다. 둘 다 이 프로토콜에 대한 피펫을 당기는 기술의 주요 측면을 개발하는 데 도움이 되었습니다.

화염 위에서 유리 피펫을 가열하고 구부린 다음 유리 커터를 사용하여 깨끗하게 절단합니다. 그런 다음 곡면 유리를 섭씨 160도에서 약 45분 동안 살균합니다. 기술에 맞는 파이펫의 올바른 곡선을 얻으려면 연습이 필요합니다.

들쭉날쭉한 유리가 없도록 항상 유리 커터로 피펫을 절단하십시오. 또한 조직에 적합한 직경의 끝부분을 가지고 있는지 확인하고 싶습니다.0.2 미크론 필터를 통해 BSA가 있는 lebowitz L 15 배지로 만든 해부 매체를 살균하도록 제작되었습니다. 이는 신생아 난소 배양을 살균하기 위해 제작된 직경 25mm입니다.

직경이 25mm에 불과한 다른 0.2미크론 필터를 통해 매체를 통과하고 멸균 튜브에 수집합니다. 그런 다음 24개의 각 웰에 1ml의 신생아 배지를 추가합니다. 웰 플레이트를 만들고 각 웰의 매체 표면에 멤브레인을 옮깁니다.

여포 배양 배지는 또한 난소 배양 배지와 같이 필터 멸균됩니다. 그런 다음 실리콘 오일도 필터로 살균해야 합니다. 다음으로, 상단 줄을 따라 30마이크로리터의 난포 배지 방울로 96개의 웰 배양 플레이트를 수리합니다.

이 웰에 70마이크로리터의 실리콘 오일을 조심스럽게 오버레이합니다. 또는 여포 여포 공동 배양에는 100마이크로리터의 실리콘 오일이 오버레이된 100마이크로리터의 배지가 필요합니다. 그런 다음 웰당 1ml의 배지와 매우 조심스럽게 배치된 UV 멸균 핵포막으로 여포 난소 공동 배양 플레이트를 준비합니다.

먼저 1ml의 박리 배지를 각 멸균 유리 배아 접시에 옮깁니다. 0-5 산후 일 된 새끼를 색칠 한 후 복벽을 덮고있는 피부를 미세한 집게로 잡고 피부와 몸 벽을 뚫습니다. 복부가 드러나는 이 큰 절개 부위를 당겨 엽니다.

방광은 일반적으로 이 단계에서 충혈되며 더 쉽게 해부할 수 있도록 구멍을 뚫을 수 있습니다. 워치메이커 집게를 사용하여 내장을 옆으로 움직입니다. 그런 다음 양쪽에서 방광에서 신장까지 자궁 뿔을 따라

난소는 자궁 상단의 신장 바로 아래에 위치한 구름 모양의 구조입니다. 가위를 사용하여 난소를 부드럽게 잡습니다. 자궁에서 잘라냅니다.

양쪽 난소를 모두 절개한 후 따뜻한 절개가 채워진 접시에 옮깁니다. 보통. 섭씨 37도로 가열된 스테이지가 있는 해부 현미경을 사용하여 인슐린 바늘을 사용하여 난소를 해부합니다. 난소만 남을 때까지 기저낭과 나팔관을 포함한 여분의 물질을 잘라냅니다.

그런 다음 곡선 피펫을 사용하여 각 난소를 준비된 플레이트의 웰로 옮깁니다. 각 멤브레인 배양액에 하나의 난소를 배치하고, 배지를 변경할 때 최대 6일 동안 격일로 배지의 절반을 변경하는 조직, 멤브레인을 방해하지 않도록 배지 웰의 가장자리에 피펫 팁을 놓습니다. 배양 후, 난소는 냉동 또는 고정 또는 조직학 또는 면역 화학으로 보관 될 수 있습니다.

따뜻한 해부 매체 접시에 나이 든 쥐의 난소를 채취한 후 난소 Basa를 제거합니다. 인슐린 주삿바늘을 사용하여 난소만 남을 때까지 기저낭과 나팔관을 포함한 여분의 물질을 잘라냅니다. 그런 다음 바늘을 사용하여 난소를 반으로 자르고 각 절반을 1ml의 해부 매체가 들어있는 개별 시계 유리에 조심스럽게 옮깁니다.

시계 유리를 유리 슬라이드로 덮고 가능한 한 빨리 최대 한 시간 동안 오븐에 보관하십시오. 얇은 판 유동 후드의 가열된 스테이지에서 현미경으로 작업하고 인슐린 바늘을 사용하여 난소를 큰 조각으로 절개하여 후기 전막 난포를 식별합니다. 전안낭 여포는 2-3층의 과립증 세포를 포함하고 있으며 직경은 약 180-200마이크로미터입니다.

인라인 바늘과 바늘 홀더로 고정된 침을 사용하여 이러한 중 하나를 해부하고 기저판이 손상되지 않도록 하되 주변의 S 기질을 제거해야 합니다. 이것은 연습이 필요합니다. 난포는 약간의 배설물 조직이 필요하지만 너무 많지는 않습니다.

또한 해부 과정이 너무 거칠면 난포가 손상되어 파열되거나 죽게 됩니다. 배양 중에 사용자는 모낭을 조심스럽게 매체로 채워진 새로운 시계 유리로 옮기기 위해 퍼페를 준비했습니다. 해부 현미경에 장착된 보정된 접안렌즈를 사용하여 퍼펫의 얇은 구경 부분에 있는 모낭을 유지합니다.

난포를 측정합니다. 지름 190마이크로미터에서 10마이크로미터 이내에 있는 경우. 그들은 배양에 사용될 수 있으며, 선택한 여포에서 다른 여포를 버릴 수 있습니다.

배양을 위해 가장 건강한 것만 선택하십시오. 그들은 더 어두운 retic 영역이 없이 반투명해야 하며, 손상되지 않은 기저 층류와 일부 부착된 척추 조직이 있어야 합니다. 좋은 수율은 난소당 10-15개의 여포입니다.

이제 준비된 곡선 퍼프를 사용하여 이 여포를 준비된 96웰 배양 플레이트로 옮깁니다. 오일 층과 배양 아래의 각 웰에 하나의 여포를 놓습니다. 난포는 매일 최대 6일까지 지속됩니다.

미디어가 있는 새 행을 준비합니다. 한 시간 이상 후, 여포를 새로운 평형 배지 또는 여포 여포 공동 배양 두 개의 여포를 하나로 나란히 배양하는 다음 행으로 옮깁니다. 글쎄요, 옮기는 대신 미세한 젤 팁을 사용하여 격일로 배지의 절반을 교체하십시오.

난포 난소의 경우, 공동 배양은 배양 플레이트의 막에 놓인 신생아 난소로 여포를 옮기고, 신생아 난소의 한쪽 극 옆에 여포를 조심스럽게 놓아 서로 접촉할 수 있도록 합니다. 이 문화를 최대 5일 동안 유지합니다. 격일로 500마이크로리터의 배지를 교체합니다.

전내엽(pre antal follicles)은 종종 신생아 난소(neonatal opolies)에 의해 캡슐화됩니다. 이 배양 기간 동안 신생아의 신생아 난소를 6일 동안 배양하고 생식 독성 물질에 노출시켰습니다. 배양 둘째 날에는 조직을 처리하여 여러 단계의 난포 수와 건강 상태를 확인했습니다.

조사된 독성 물질 중 하나는 시스플라틴이었다. 조사된 다른 독성 물질은 독소루비신(doxorubicin)이었다. 다른 실험에서는 성선 자극 호르몬 여포 자극 호르몬과 황체 형성 호르몬이 개별 난포의 성장에 미치는 영향을 조사했습니다.

그러나 이 분석 여포의 크기는 성장을 매핑하기 위해 주기적으로 측정되었습니다. 여포 여포 공동 배양은 여포를 발현하는 GFP와 야생형 여포 돌기가 하나에서 다른 것으로 확장되는 것을 사용하여 조사되었습니다. 이 공동 배양의 면역조직화학 가공은 GFP 과정이 야생 유형 내에 있다는 것을 밝혔습니다.

Thecal 층, 야생형 신생아 난소는 또한 여포를 표현하는 GFP와 공동 배양되었습니다. 이 시나리오에서 GFP 프로세스는 난소 간질을 통해 이동했습니다. 신생아 난소 배양은 매우 간단한 방법이지만 손상되지 않은 온전한 전방의 여포를 해부하는 기술을 습득하는 데 시간이 걸릴 것으로 예상됩니다.

이것은 그들의 적절한 발달에 필수적입니다. 난포 배양 후, 난모세포는 체외 수정으로 수정될 수 있으며, 그 후 배아는 유사 임산부로 이식되어 살아있는 새끼를 얻을 수 있습니다.