2015년 4월 30일
이 보고서는 TriKinetics Drosophila Activity Monitor를 사용하여 초파리 유충 활동을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 장치는 적외선 빔을 사용하여 최대 16 마리의 개별 동물의 움직임을 감지합니다. 데이터를 분석하여 분석 챔버 내 동물의 비율 및 위치를 포함한 모션 매개변수를 나타낼 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 복잡한 비디오 분석 소프트웨어를 사용하지 않고 유충 활동을 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 선택한 유충을 메쉬 필터로 옮겨 파편을 제거함으로써 수행됩니다. 다음으로 개별 유충은 분석 튜브로 옮겨져 오거 플러그로 고정되며, 이 플러그는 초파리 활동 모니터 또는 댐 장치에 삽입됩니다.
3분에서 5분 동안 적응한 후 분석을 위해 DAM 시스템에서 녹음을 가져옵니다. 궁극적으로 댐에서 측정한 유충 이동은 주어진 유전자형에 대한 다양한 활동 매개변수를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술이 기존 방법에 비해 갖는 한 가지 장점은 자동화되고 객관적이라는 것입니다.
일상적인 활동 측정을 할 수 있을 만큼 간단하지만, 많은 실험실에는 이미 유충에 쉽게 적용할 수 있는 필요한 장비가 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학부생인 Aiden McFarlin입니다. 이 프로토콜은 M five 다중 빔 초파리 활동 모니터 장치 또는 댐을 사용합니다.
댐을 설정합니다. 먼저 CAB six 전화 케이블을 사용하여 모니터를 전원 공급 장치 인터페이스 장치 또는 PSIU에 연결합니다. 그런 다음 PSIU를 전원 콘센트에 연결합니다.
녹색 표시등은 적절한 연결을 나타냅니다. 셋째, 데이터 기록을 위해 USB 케이블을 통해 PSIU를 컴퓨터에 연결합니다. 이제 컴퓨터에 DAM 시스템 MB one V six X 프로그램을 설치하고 엽니다.
소프트웨어가 열리면 소프트웨어 컨트롤에 자동으로 데이터 기록이 시작됩니다. 댐의 경우 원하는 녹음 간격을 설정합니다. 기본 설정을 선택한 다음 읽기 간격 옵션의 위 또는 아래를 클릭하여 데이터가 저장될 다른 기간을 선택합니다.
설정할 수 있는 다른 다양한 매개 변수가 있으며, 기본 설정 및 출력 데이터 유형에서 찾을 수 있습니다. 각 매개변수는 튜브 내 유충 활동에 대한 고유한 분석을 제공합니다. 데이터를 수집하기 전에 모든 매개 변수를 선택하는 것이 좋습니다.
측정하려는 매개변수가 확실하지 않은 경우 이 분석을 위해 분석하려는 각 유전자형에 대해 먹이 유충이 있는 바이알을 준비하십시오. 표준 환경을 사용하고 사료를 날려 분석 튜브를 준비합니다. 페트리 접시에 4cm 깊이까지 1.5% 오거 용액을 붓습니다.
이것은 분석 튜브의 플러그 재료가 되며, 너무 빽빽하여 파묻을 수 없습니다. 다음으로, 튜브를 뜨거운 물로 씻어내어 튜브가 깨끗하고 막히지 않았는지 확인하십시오. 다음으로, 물 100ml가 든 스퀴즈 병을 전자레인지에 10-15초 동안 또는 응결이 나타날 때까지 가열합니다.
그런 다음 병을 뒤집고 따뜻하고 습한 공기를 분석 튜브로 부드럽게 짜냅니다. 튜브 벽에 얇은 응결 층이 나타나면 충분히 습한 것입니다. 그런 다음 접시에서 젤 디스크를 제거하고 단단히 부착되지 않는 메쉬 표면 위에 놓습니다.
유충을 모으려면 깔때기 위에 실크 스크린 등급의 나일론 메쉬를 늘려 메쉬 필터를 준비합니다. 깔때기 목의 메쉬를 고무 밴드로 고정하고 깔때기를 비커에 배치합니다. 이제 배양 병에서 먹이를 찾는 유충이 들어 있는 먹이를 가득 채운 주걱을 떠서 메쉬 필터로 옮깁니다.
실온, 수돗물을 사용하여 유충에서 음식을 씻어내고 페인트 브러시를 사용하여 메쉬에서 개별 유충을 수집할 수 있습니다. 유충을 약 1.5인치 정도 습한 분석 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 오거로 연결하여 튜브를 밀봉합니다.
이것은 튜브의 한쪽 끝을 젤에 두 번 누르고 다른 쪽 끝을 눌러 수행됩니다. 압력으로 인해 두 개의 플러그 중 하나가 반대쪽 끝에서 강제로 분리되면 튜브가 적재될 때 댐에 넣습니다. 다음으로, 동물이 센서 범위를 벗어나지 않도록 각 튜브의 위치를 조정합니다.
그런 다음 퍼티 링을 사용하여 튜브를 장치에 고정합니다. 섭씨 20도의 인큐베이터에서 LARVAS 활동을 기록하여 그림자, 형광등 또는 실험실의 온도 변화로 인해 발생할 수 있는 부정확한 판독을 방지합니다. 인큐베이터에서.
녹화 중에는 형광등이 아닌 LED 조명을 사용하십시오. 데이터를 수집하기 전에 유충이 5분 동안 적응하도록 합니다. 조명 조건이 DAM 센서를 트리거하지 않도록 동물 없이 시험을 수행하는 것이 유용할 수 있습니다.
5분 후 사전 구성된 DAM 소프트웨어를 시작하여 녹음을 시작합니다. 분석은 추가 응결이나 음식 없이 30분 동안 진행될 수 있습니다. 활동을 기록하기 전에 기본 설정에서 분석을 위한 매개 변수를 선택해야 합니다.
이 옵션을 선택하지 않으면 사후 분석에 이 활동을 사용할 수 없습니다. 원하는 기록 시간이 완료되면 DAM 소프트웨어를 닫으면 데이터가 자동으로 dam 시스템 데이터 폴더 아래에 저장됩니다. 나중에 처리할 수 있도록 데이터 파일을 별도의 폴더로 전송합니다.
분석 튜브는 재사용을 위해 끓는 물로 세척할 수 있습니다. 원시 데이터를 이해할 수 있는 형식으로 처리하려면 DAM 파일 스캔 응용 프로그램을 열고 선택합니다. 입력 데이터 폴더를 선택한 다음 데이터 폴더와 원하는 파일을 선택하고 스캔 옵션을 선택합니다.
마지막으로 원하는 판독 기간의 빈 길이를 선택합니다. 이렇게 하면 원시 데이터가 연산자가 설정한 매개 변수로 구성됩니다. 이제 출력 데이터 유형을 선택하여 원하는 모션 설정을 분석합니다.
빈 길이가 선택한 시스템 판독 간격보다 크면 추가 판독값 메뉴로 이동하여 두 개의 sum into bins 옵션을 선택합니다. 그런 다음 원시 데이터가 전송된 폴더와 동일한 폴더에 적절한 이름으로 파일을 저장합니다. 표준 스프레드시트 프로그램을 사용하여 저장된 파일을 엽니다.
분석된 데이터 유형에 따라 스프레드시트를 다르게 읽어야 합니다. 일반적으로 이동 또는 계수를 측정하기 위해 연구 기간은 숫자로 기록되고 각 개별 판독 튜브는 지정된 문자를 받게 됩니다. 일반적으로 K에서 Z까지의 열은 분석 튜브의 슬롯을 나타내고 행은 수집된 데이터 포인트를 나타냅니다.
예를 들어, 20분 동안 이동이 수집된 경우 1분 동안 간격은 20개 행의 평균을 구하여 분당 평균 이동 횟수 및 기타 측정값을 계산합니다. W 1 1 1 8 균주의 세 번째 instar 유충에 대한 온도 반응 연구는 유충, 운동의 차이를 감지하기 위해 모니터링 장치를 사용하여 이루어졌습니다. 7개의 서로 다른 온도에서 각 유충을 20분 동안 분석했습니다.
분명히, 유충은 환경이 뜨거워짐에 따라 훨씬 더 활동적이 되었습니다. 비교를 위해 W 1 1 18 균주의 저활성 돌연변이를 비활성이라고 하는 것으로 테스트되었습니다. 분석 결과, 비활성 유충은 분석의 검출 한계를 테스트하기 위해 대조군보다 이동성이 현저히 낮다는 것을 나타냈습니다.
다른 단계의 유충을 비교하는 것이 이루어졌지만 별 유충은 세 번째 유충보다 훨씬 작았습니다. 별 유충에서 첫 번째와 두 번째의 활동은 실제로 감지 가능하고 측정 가능했으며, 장치에서 시간에 따른 활동 변화를 조사했습니다. 20분 분석의 매 분마다 별 유충에서 3번째의 활성이 비교적 일관되게 유지되는 것이 발견되었습니다.
일단 숙달되면 이 프로토콜은 다양한 실험 조건에서 유충 활동의 기본 매개변수를 평가할 수 있는 정확하고 간단하며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.
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이 보고서는 TriKinetics Drosophila 활동 모니터를 사용하여 Drosophila 유충의 활동을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 장치는 적외선 빔을 사용하여 최대 16개의 개별 동물의 움직임을 감지하여 시험 챔버 내의 속도 및 위치를 포함한 운동 매개변수를 분석할 수 있게 합니다.
This protocol enables automated, objective measurement of Drosophila larval locomotion using an adapted TriKinetics activity monitor, providing a scalable, cost-effective alternative to video-based behavioral assays. By delivering quantitative movement data across genotypes and environmental conditions, it supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurobehavioral discovery pipelines. The method enhances predictive confidence in larval phenotype screening by standardizing activity readouts for high-throughput genetic or pharmacological studies.
The method integrates into early discovery workflows as a phenotypic screening tool for target validation, bridging genetic manipulation to quantifiable behavioral output before lead identification stages.