생체 내 및 생체 외 복막 지방이에 밀키 스팟 구조의 난소 암 전이성 식민지를 연구하는 접근 방식

이 절차의 전반적인 목표는 복막 지방 저장소의 난소암 집락화를 정량화하기 위해 표준 기술의 사용을 입증하는 것입니다. 이것은 특정 시점에서 마우스를 희생한 후 난소암 세포를 마우스에 복강내 주입을 통해 이루어집니다. 복막 지방 저장소(peritoneal fat depots)가 확인되고 마우스에서 분리됩니다.

마지막으로, 특정 지방 저장소(specific adipose depots)에 존재하는 난소암 세포의 수는 유세포 분석을 사용하여 정량화합니다. 메커니즘 기반 연구 외에도 난소암 세포 집락화는 체외 공동 배양에서 연구한 후 적절한 정량 및/또는 분자 분석을 수행할 수도 있습니다. 궁극적으로, 이러한 생체 내 및 생체 외 접근법은 정성적 또는 정량적 방법을 통해 복막 지방의 난소암 세포 집락화와 관련된 과정을 조사할 수 있습니다.

이 접근법의 주요 장점은 복막 지방의 난소 암 전이성 집락화의 특정 단계를 평가하기 위한 표준 기술을 구현할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 전이 방지를 확장합니다. 특히, 유백색 반점으로 알려진 구조를 포함하는 면역 세포 내에서 난소암 세포의 성장을 조절하는 암세포 미세환경 상호 작용을 식별할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 쥐를 다루는 경험이 있으면 도움이 될 것입니다. 복강내 주사는 겉보기에는 간단해 보이지만 좋은 기술이 없으면 데이터가 부정확해질 수 있습니다. 또한, 단세포 현탁액으로의 조직 해리는 실험을 시작하기 전에 연습과 세심한 계획이 필요합니다.

이 특별한 기술은 동물이 마취를 할 필요가 없습니다. 승인된 프로토콜에 따라 살아있는 동물에 대해 이 기술을 수행합니다. 500마이크로리터의 형광 태그가 부착된 단일 세포 현탁액을 주사기에 로드합니다.

그런 다음 주사기를 멸균 뚜껑이 있는 25게이지 바늘에 넣어 주입 전에 세포 전단을 줄입니다. 다른 손으로 마우스를 잡고 목덜미를 잡고 손바닥과 검지를 사용하여 꼬리를 잡습니다. 그런 다음 복부 장기에 외상을 입히지 않도록 왼쪽 뒷다리를 약지와 새끼 손가락 사이에 고정합니다.

주입 중에 마우스가 움직일 수 없도록 마우스를 잘 제지하십시오. 복부를 가로지르는 선을 상상하고 동물의 오른쪽과 정중선에 가까운 점을 찾습니다. 진입 지점은 두개골 2호이며 마지막 유두의 약간 내측입니다.

쥐의 오른쪽에 바늘을 삽입하여 맹장을 피하고 장에 구멍을 뚫을 위험을 줄일 준비를 합니다. 마우스 복부의 아래쪽 측면 영역에 바늘을 약 0.5cm 깊이로 삽입합니다. 플런저를 뒤로 당겨 바늘이 혈관이나 기타 복막 기관을 관통하지 않았는지 확인합니다.

유체를 흡입하지 않으면 느리고 일정한 압력을 사용하여 샘플을 주입합니다. 그런 다음 바늘을 빼고 마우스를 케이지로 되돌립니다. 날카로운 물건 용기에 폐기하기 전에 주사기를 다시 뚜껑을 닫지 마십시오.

중요한 장기 제거를 위해 주사 후 특정 시점에 마우스를 희생시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 복막 지방 저장소를 채취하는 것은 내부 장기 제거를 구성합니다. 복막벽을 통해 서혜부 페이프에 가까운 정중선을 절개하여 내부 장기를 노출시켜 난소 지방을 절제합니다.

생식선 지방을 위한 집게로 복막강에서 비장을 확장하여 난소 췌장 복합체를 노출시킵니다. 집게를 사용하여 난소를 둘러싼 생식선 지방을 들어 올리고 조직 연결을 절단하여 절제합니다. 즉시. 티슈를 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다.

다음으로, 집게를 사용하여 자궁 뿔을 둘러싼 자궁 지방을 들어 올려 자궁 지방을 제거하고 조직 연결을 절단하여 절제한 후 조직을 얼음처럼 차가운 PBS에 즉시 넣습니다. 장간막 지방을 얻을 때는 소장과 유문 사이의 접합부를 잘라냅니다. 집게를 사용하여 소장의 다른 쪽 끝을 단단히 잡고 장간막 지방에서 천천히 벗겨냅니다.

해부 가위를 사용하여 장간막 뿌리에서 장간막 지방을 방출합니다. 그런 다음 즉시 조직을 얼음처럼 차가운 PBS에 넣으십시오. 마지막으로, 흉골 문맥 지방을 제거하려면 집게를 사용하여 비장의 말단 끝을 들어 올려 조직의 얇은 지방 띠를 노출시켜 비장의 문턱을 췌장에 연결합니다.

pleo portal fat을 먼저 췌장에서 방출한 다음 비장에서 조심스럽게 절제하여 절제합니다. 그런 다음 즉시 조직을 PBS에 넣어 체중을 시작합니다. 모든 지방 조직을 망막에 맞춥니다.

조직을 1.5ml의 무혈청 ECCO, 변형 독수리 배지 또는 DMEM 및 0.1% 소 혈청 알부민이 포함된 별도의 5ml 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석을 위한 충분한 세포 수율을 보장하기 위해 3개의 독립적인 마우스에서 수확한 조직을 모읍니다. 다음으로 수술용 가위를 사용하여 조직을 다지고 0.4% 콜라겐 분해 효소 1.4을 함유한 무혈청 DMEM 1.5ml를 첨가합니다.

섭씨 37도에서 30분 동안 조직 현탁액을 배양하고 선택적 단계로 회전 혼합을 합니다. 저작에 의해 조직을 더 해리합니다. 이 경우, 조직 콜라겐분해효소 현탁액을 미세한 위나 백으로 옮기고 저온에서 10분 동안 저작하고 5분 후에 백의 방향을 회전시킵니다.

그런 다음 나일론 메쉬 필터를 통해 샘플을 필터링하여 큰 파편을 제거합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 250배 G의 원심분리를 통해 세포를 수집하고 상등액 분획을 버립니다. 세포 펠릿을 100마이크로리터의 PBS와 900마이크로리터의 염화암모늄, 칼륨 용해, 완충액과 결합하여 실온에서 1분 동안 배양합니다.

그런 다음 이전과 같이 세포를 다시 원심 분리하고 소련 후 상등액을 버리고 250 마이크로 리터의 얼음 차가운 PBS에 세포 펠렛을 현탁시키고 60 미크론 붓기 나일론 메쉬를 통해 샘플을 부어 단일 세포 현탁액을 보장합니다. 그런 다음 250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 필터를 헹구고 형광 태그가 지정된 세포와 소생을 준비합니다. 밀리리터당 200만 개의 세포 농도로 현탁합니다.

약 6마이크로리터의 조직 접착제를 배양막에 도포합니다. 삽입하고 자연 건조시키십시오. 그런 다음 멤브레인을 멸균수로 두 번 세척하여 과도한 접착제를 제거합니다.층류 후드 아래에서 멤브레인을 공기 건조하기 전에 OA를 조심스럽게 절제하고 멸균 집게를 사용하여 접착 코팅된 멤브레인에 부착합니다.

조직이 1분 동안 멤브레인에 부착되도록 한 후 각 배양 삽입물의 각 오멘텀 위에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 그런 다음 트랜스웰 챔버 주변을 2.5ml의 DMEF 12 매체로 채웁니다. 5%CO2 환경에서 섭씨 37도에서 6시간 동안 세포 현탁액으로 OA를 배양합니다.

약 10ml의 PBS로 OA를 조심스럽게 제거하고 세척하십시오. 마지막으로, 적절한 형광 이미징 시스템을 사용하여 형광 암 세포 병소를 시각화합니다. 복막 지방 저장소의 상대적 위치는 전체 해부학적 해부를 통해 볼 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 Pleo portal과 omental adipose에 대한 자세한 모습입니다. 절제된 지방 저장소의 상대적 크기가 여기에 나와 있습니다. 유백색 반점은 표준 조직학을 사용하여 omental 및 pleo portal adipose에서 관찰됩니다.

다양한 복막 지방 저장소의 흐름 분석에서 얻은 정량적 결과가 표시됩니다. 분석에 대한 게이팅 기준은 다음과 같습니다. 관념적 부모 세포는 음성 대조군으로 사용되었습니다.

난소 조직 제제는 자궁 중액 지방 및 생식선 지방에 비해 상당한 양의 TD 토마토 양성 세포를 함유하고 있었습니다. 정량화된 유세포 분석에서 데이터는 PBS 주입 생쥐에 비해 TD 토마토 양성 이벤트의 평균 폴드 변화 증가 및 SKV 3, IP 1 GFP 난소암 세포에 의한 OA의 생체 외 집락화로 표현됩니다. 전체 OA의 형광 이미징은 in vivo 및 ex vivo 분석 모두에서 암세포 국소화의 유사한 집락화 패턴을 보여주었습니다.

이 조직에 대한 조직학적 검사는 유백색 반점에 국한된 암 세포의 존재를 확인했습니다. 마지막으로, SKO V three IP one GFP cell에 의해 발현되는 cytokeratin의 면역조직화학적 검출은 이러한 조직학적 소견을 확인합니다. 이 절차를 시도하는 동안 복막 지방 조직을 식별하고 신중하게 절제하고 다른 조직 유형에 의한 오염을 방지해야 하며, 이로 인해 유세포 분석에서 얻은 정량적 데이터가 왜곡되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.

둘째, 해당 연구에 적합한 내 균주를 선택하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 전이 형성에 중요한 omentum 미세환경에서 잘 확립된 난소암 세포주의 상호 작용을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 나팔관에서 볼 수 있는 초기 병변을 모델링하는 세포주의 악성 가능성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.