분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

이 절차의 전반적인 목표는 신생아 쥐의 심근세포를 동결 보존한 후 체외 연구에 사용하기 위해 세포를 해동하는 것입니다. 이것은 신생아의 심장을 작은 조각으로 다지음으로써 이루어진다. 그런 다음 심근세포는 효소를 통해 심장 조직에서 해리되고 동결 보존된 후 최종적으로 후속 세포 배양을 위해 해동됩니다.

궁극적으로, 해동된 세포는 관심 심장 마커의 면역형광 분석을 포함한 다양한 체외 분석에 사용할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 분석에 세포가 필요할 때 완전한 심근세포 분리를 수행할 필요가 없어 시간을 절약할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 분리 및 처리 단계에서 샘플의 올바른 크기와 일관성을 아는 것과 관련된 뉘앙스를 직접 시연하지 않고는 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

신생아의 심장을 모두 채취한 후, 샘플에서 심장이 아닌 조직을 모두 제거하고 HBSS와 부드럽게 소용돌이치며 심장을 씻습니다. 두 번째 세척과 새 플레이트를 만든 후 샘플을 1-3입방밀리미터 조각으로 자르고 조직을 40ml의 콜드 트립신으로 옮겨 로커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날, 트립신이 투명하고 조직이 푹신푹신해 보이는 것을 확인합니다.

조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 가능한 한 많은 액체를 흡입합니다. 다음으로, 25 밀리리터의 따뜻한 NR cm에서 10 % FBS가 함유 된 매체를 튜브에 넣고 손으로 휘젓습니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 2분 동안 넣습니다.

조직이 뜨기 시작하면 튜브 바닥에서 상층액을 흡인하고 갓 준비한 콜라겐 분해 효소 10ml에서 용액이 흐려질 때까지 조직을 수조에 다시 2분 더 넣습니다. 그런 다음 S 상층액을 빠르게 흡인하고 또 다른 회전 배양을 위해 10ml의 신선한 콜라겐 분해 효소를 추가합니다. 마지막 2분 후, 조직 슬러리를 몇 번 반복하고 가능한 한 많은 상층액을 얼음 위에 4ml의 HBSS가 들어 있는 5개의 15ml 튜브 중 첫 번째 튜브로 옮깁니다.

HBSS의 각 튜브에 샘플 튜브의 상층액이 포함될 때까지 분해를 반복한 다음 모든 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 각 펠릿에서 상층액을 흡인하고 각 튜브의 세포를 6ml의 HBSS로 재현탁합니다. 이제 40미크론 스트레이너를 통해 세포를 50밀리리터 원추형 튜브에 모읍니다.

그런 다음 각 15ml 튜브의 측면을 3ml의 차가운 HBSS로 헹구고 50ml 원뿔형 튜브로 세척제를 당겨 넣습니다. 세포를 다시 회전시킨 후 펠릿을 10ml의 예열 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 50 밀리리터 튜브에서 5 밀리리터의 세척과 함께 세포를 T 75 플라스크로 옮기고 섭씨 37도와 5 % 이산화탄소에서 1 시간 동안 세포를 배양합니다.

배양이 끝나면 T 75 플라스크에서 15ml를 세척한 T 1 75 플라스크로 세포를 옮기고 다시 한 시간 동안 세포를 배양합니다. 세포를 동결 보존하기 위해 세포 배양에서 부유 세포를 50ml 원뿔형 튜브로 분취합니다. trian blue exclusion에 의한 계수를 위해 10마이크로리터를 예약하고 원심분리 계수 중에 세포를 스핀다운합니다.

그런 다음 펠릿을 2-4 배 10 밀리리터 당 6 셀로 동결 매체에 다시 현탁시킵니다. 1밀리리터의 세포 분취액을 극저온 바이알로 옮기고 바이알을 냉각 속도가 조절된 냉동 용기에 넣은 다음 1-2일 이내에 섭씨 영하 80도에서 단기 보관한 다음 바이알을 액체 질소로 옮깁니다. 세포를 해동할 때.

먼저 배양 플레이트의 바닥을 덮을 만큼 충분한 피브로넥틴을 접시에 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 접시를 배양합니다. 접시가 준비되면 셀을 드라이아이스에 놓고 섭씨 37도의 수조에서 데웁니다. 세포 현탁액이 방금 해동되면 마지막 세척 후 즉시 원심분리로 세포를 4회 세척하고 트라이암 블루 배제로 생존 가능한 세포를 계수하고 펠릿을 신선한 배지에 재현탁합니다.

마지막으로, 피브로넥틴이 코팅된 접시에서 분석을 위한 적절한 농도로 세포를 배양합니다. 일주일 동안 매일 배지를 새로 고쳐 세포가 박동하기 시작해야합니다. 일반적으로 해동 시 세포의 생존력은 40에서 60% 사이가 되지만 이는 다른 세포 유형에서 관찰된 것보다 낮습니다.

적절한 파종과 배양을 통해 세포가 증식합니다. 배양 후 약 3일 이내에 세포가 자발적으로 수축하기 시작해야 하며, 이는 위상차 현미경 검사로 확인할 수 있습니다. 이 대표적인 실험에서, 세포는 알파 육종 액틴으로 표지된 웰당 5번째 세포에 2배 10의 4개의 웰 배양 슬라이드에 도금되고 형광 현미경으로 이미지화되었습니다.

여기에서 녹색 염색으로 나타나는 수많은 알파 육종 액틴 양성 세포가 확인되어 신생아 쥐 심근세포의 존재를 확인했습니다. 이러한 세포를 사용하여 다른 다운스트림 분석도 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 본 대표적인 실험에서는 신생아 랫드의 심근세포를 인간 심장줄기세포 유래 엑소좀으로 배양하여 인간 소포의 재생 특성을 시험하는 한편, 이 절차의 해동 부분을 수행하였다.

생존 가능한 세포 수율을 보장하기 위해 빠르고 정확하게 행동하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 체외 연구에 사용하기 위해 냉동 보존을 성공적으로 분리한 다음 신생아 쥐 심근세포를 해동하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.