세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달 ₂ - 그의 ₂ 아연 손가락 도메인

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

이 절차의 전반적인 목표는 아연 손가락 도메인을 사용하여 녹색 형광 단백질과 같은 기능적 단백질을 포유류 세포에 전달하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 아연 핑거 도메인에 번역 융합된 에메랄드 그린 형광 단백질 MGFP를 포함하는 발현 플라스미드를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 박테리아에서 형광 융합 단백질을 발현하는 것입니다.

다음으로, 박테리아 세포를 용해시키고 형광 융합 단백질을 정제합니다. 마지막 단계는 포유류 세포를 정제된 형광 융합 단백질로 배양하여 흡수를 허용하는 것입니다. 궁극적으로, 처리된 세포의 형광은 유세포 분석법으로 정량화하여 세포로의 융합 단백질 전달 효율성을 결정할 수 있습니다.

HIV 유래 타이트 펩타이드 또는 폴리 아르기닌과 같은 도둑 또는 기타 단백질 전달 도메인의 주요 장점은 필드 효소 화물의 활성을 손상시키지 않으면서 높은 수준의 세포질 전달을 촉진할 수 있다는 것입니다. PCR을 시작하려면 플라스미드에서 에메랄드 GFP 또는 MGFP 염기서열을 증폭합니다.텍스트 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제한 다음 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 정량화합니다. 다음으로, 알라닌의 서열을 포함하는 PET28 발현 벡터를 얻는다.

두 개의 손가락, 아연 손가락 또는 두 개의 FZ 도메인, 소화 벡터 및 MG F-P-P-C-R 생성물을 DNA 마이크로그램당 10단위의 효소를 사용하여 XMA 1 및 SAC 1 제한 효소로 대체하고 섭씨 37도에서 3시간 동안 다이제스트를 배양합니다. 겔 추출로 DNA 단편을 정제하고 벡터와 MG F-P-P-C-R 제품의 농도를 측정합니다. 분광 광도계를 사용하여 MG F-P-P-C-R 제품과 50-100 나노그램의 벡터를 6:1 인서트 대 벡터 몰 비율로 단일 튜브에 결합합니다.

그런 다음 1단위의 T 4 DNA 리가아제를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응을 배양하여 결찰된 플라스미드로 박테리아를 형질전환시킵니다. 녹다. 얼음 위의 화학적으로 유능한 대장균 세포의 50마이크로리터 분취액. 그런 다음 세포를 100-20 나노그램의 결찰된 DNA와 부드럽게 혼합하고 30분 동안 얼음 위에서 DNA와 함께 세포를 배양합니다.

배양 후 섭씨 42도에서 90초 동안 세포에 열 충격을 가합니다. 튜브에 2ml의 SOC 배지를 추가하고 세포가 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들어 형질전환체를 선택하도록 합니다. 캔 마이신(can, mycin) 1밀리리터당 50마이크로그램이 들어 있는 LB 한천 플레이트에 100마이크로리터의 배양액을 펴고 다음 날 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

캔 마이신(can mycin) 1밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 6밀리리터 배양의 LB를 하룻밤 플레이트에서 분리된 콜로니(colony)에 접종합니다. 섭씨 37도에서 밤새 흔들면서 배양을 배양하십시오. 다음 날, 세포를 채취하고 미니 프렙하여 플라스미드를 분리한 다음 프라이머로 염기서열분석을 통해 플라스미드를 확인합니다.

T seven promoter의 경우, 플라스미드는 MGFP에 대한 2개의 FZ 도메인의 N 말단 translational fusion을 포함해야 합니다. 단백질 정제를 시작합니다. 먼저 BL 21을 정제된 플라스미드 100나노그램으로 균등화합니다.

날 캔 마이신을 함유 할 수 있습니다 LB 한천에 형질 전환체를 선택하고, 하룻밤 플레이트에서 단일 콜로니로 캔 마이신을 함유 한 LB 배지의 10 밀리리터 배양을 접종하고 쉐이킹으로 섭씨 37도에서 밤새 배양액을 배양하고, 전체 하룻밤 콜로니를 1 리터의 LB 배지로 희석하고, 캔 마이신 0.2 % 포도당 및 100 마이크로 몰 염화 아연을 보충합니다. 600 나노미터의 광학 밀도에서 0.8에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 진탕과 함께 배양한 다음 IPTG를 최종 농도인 2밀리몰에 첨가하여 발현을 유도합니다. 감응작용의 6 시간 후에 세포를 가을걷기 위하여 5, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 G 000 시간에 배양물을 원심 분리하십시오.

세포 펠릿을 5ml의 용해 완충액에 다시 현탁시킨 다음 50%의 출력을 사용하여 태양으로 얼음 위에서 세포를 용해하고 4분 동안 5초 동안 10초 오프 사이클을 사용합니다. 다음으로, 원심분리기 세포는 섭씨 4도에서 30분 동안 25, 000배 G로 용해한 다음 상등액을 얼음 위의 새 수집 튜브로 옮깁니다. 단백질을 정제하려면 1ml의 니켈 질산 슬러리로 미리 포장된 컬럼에 상등액을 로드합니다.

상등액을 컬럼에 통과시킨 후 20ml의 세척 버퍼로 수지를 세척합니다. 5ml의 용리 완충액으로 컬럼의 단백질을 용리시킨 다음 용액을 투석 튜브로 옮기고 투석 후 밤새 단백질과 저장 완충액을 투석합니다. 스핀 농축기를 사용하여 1시간 동안 G 3000배를 원심분리하여 단백질을 최소 40마이크로몰로 농축합니다.

단백질 농도와 순도를 보관을 위한 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 측정합니다. 1.5 밀리리터 fuge 튜브에 200 마이크로리터의 단백질을 넣고 튜브를 호일로 덮어 광표백으로부터 MGFP 융합 단백질을 보호합니다. 그런 다음 번쩍이고 액체 질소에서 단백질을 동결하고 섭씨 음의 80도에서 보관하여 단백질 전달을 준비합니다.먼저 500 마이크로 리터의 50 마이크로 리터 용액이있는 24 웰 플레이트의 웰을 preco.

섭씨 25도에서 30-60분 동안 폴리리신. 세포 배양을 파종하기 전에 웰에서 용액을 흡입합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 10%FBS와 1%항생제 항진균제가 포함된 DMM의 세포를 5%의 이산화탄소로 치료합니다.

세포를 수확하고 200의 조밀도에 24의 우물 판에 씨를 뿌려서, 우물 당 000의 세포. 그런 다음 배양 약 24시간 후 세포가 80-90% 융합될 때 인큐베이터에 24웰 플레이트를 놓습니다. 각 웰에서 배지를 흡인하고 500마이크로리터의 예열 혈청 프리 배지 또는 SFM으로 세포를 세척합니다.

2개의 마이크로몰 Z-M-G-F-P 단백질과 100마이크로몰 염화아연을 포함하는 250마이크로리터의 SFM을 각 웰에 첨가한 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 우물에서 배지를 흡인하고 헤파린 1밀리리터당 0.5mg이 보충된 DPBS로 알려진 500마이크로리터의 칼슘 및 마그네슘이 없는 도코스 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 세척합니다. 다음으로, 200마이크로리터의 0.05%tripsin EDTA를 웰에 추가하고 섭씨 37도에서 2분 동안 배양하여 플레이트에서 세포를 분리합니다.

분리된 세포를 새 튜브로 옮기고 300배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 1% FBS가 보충된 500ml의 DPBS에 세포를 재현탁시키고 앞서 설명한 대로 fite 채널을 사용하여 유세포 분석으로 샘플의 평균 형광 강도를 측정합니다. 전방 및 측면 분산을 조정하여 관심 모집단을 척도에 배치합니다.

다음으로, 정의된 게이팅을 사용하여 제어 및 테스트 샘플을 분석합니다. 10, 표본 당 000의 살아있는 환풍구를 모으고 자료를 가공하기 위하여 유세포 분석 소프트웨어를 사용하십시오. 단백질 처리된 세포의 형광 강도를 대조 혈청 처리된 세포로 정규화합니다.

Zif MGFP 융합 단백질은 대장균에서 생산되어 정제되고 SDS 페이지에 의해 분석되었습니다. 이러한 결과는 두 손가락 ZIF MG FP 융합 단백질이 95% 이상의 균질성으로 정제되었음을 보여줍니다. 헬로 세포를 ZIFF MG FP 융합 단백질의 농도를 증가시켜 처리한 경우.

그들은 2마이크로몰 농도에서 Z MG FP 융합 단백질을 사용한 유세포 분석으로 측정한 평균 형광 강도의 선량 의존적 증가를 보여주었으며, 그 결과 거의 100%의 세포가 MGFP 형광을 갖게 되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 도둑 단백질 거래 도메인을 사용하여 기능적 단백질을 내 세포에 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.