Name: 세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달 2 - 그의 2 아연 손가락 도메인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 배우세요 아연 손가락 도메인을 이용한 포유 동물 세포 내 단백질 전달 방법을. 이 프로토콜은 플라스미드 생성, 대장균 발현, 단백질 정제 및 세포 투과 과정을 포함하며, 유세포 분석으로 전달 효율을 정량화합니다.

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이 작품은과 ShanghaiTech 대학, 상하이, 중국 (DP1CA174426 카를로스 F. 바스 (Barbas)로) (JL에) 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 분자 그래픽 파이 몰을 이용하여 생성 하였다.

1. 복제 <ol><li> 애완 동물-28 발현 벡터 시스템에 클로닝 SUB 요청 (PET-2F-ZIF)에 따라 사용할 수 있습니다되었습니다 알라닌 치환 두 손가락 ZIF 도메인을 가져옵니다. (34) </li><li> PCR은 프라이머 플라스미드 에메랄드 pBAD에서 EmGFP를 증폭 5 &#39;XmaI-EmGFP (5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;; 굵게 XMA I 사이트) 및 3 &#39;를 SacI-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3&#39; ; 굵게 골목 I 사이트). <ol><li> 주형 DNA 5 ng를 10 배 중합 효소 완충액 10 μL, 증류 / 탈 이온수로 이루어진 하나의 Taq DNA 중합 효소, 0.2mM의 각각의 dNTP의 단위 (U)와 나머지 부피 100 μL 용액에서 각 프라이머의 0.2 μM 사용 . 사이클링 조건을 사용하여 5 분 동안 95 ° C를; 30 초 동안 95 ° C의 30주기, 30 초 동안 55 ° C에서 1 분 72 ° C; 10 분 동안 72 ° C에서. 겔 extracti 의해 PCR 생성물을 정제하여에와 애비 260 × 50 ㎍ / ml의 측정 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 결정한다. </li></ol></li><li> 다이제스트 애완 동물 2F-ZIF 및 제한 EmGFP을 코딩하는 삽입 DNA의 1 μg의 당 효소 10 U를 사용하여 37 ° C에서 3 시간 동안 권장 버퍼에 XMA I과 골목 I 효소. 이러한 티듐 브로마이드 인터 형광 염료를 이용한 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 DNA를 시각화. </li><li> 젤 추출 키트에 의해 소화 DNA를 정화하고 복근 260 × 50 ㎍ / ml의 측정 분광 광도계에 의해 DNA 농도를 결정한다. </li><li> 실온에서 최소 1 시간 동안 T4 DNA 리가 제 1 U를 사용하여 애완 동물 2F-ZIF의 50 ~ 100 NG로 정제 EmGFP 인코딩 DNA를 결찰. 인서트 한 투 벡터 몰비 : 최상의 결과를 위해,도 6을 사용하여 연결 반응을 수행한다. </li><li> 얼음에 어떤 화학적으로 유능한 XL-1 블루 대장균 세포의 50 μl를 해동 및 10 ~ 20 ng의 결찰 애완 동물 2F-ZIF-EmGFP의 가볍게 섞는다. </li><li> 3 얼음에 보관0 분. 열 충격 90 초 동안 42 ° C에서 혼합물은 진탕 37 ° C에서 1 시간 동안 Catabolite 탄압 (SOC) 슈퍼 최적 배지 2 ml의 세포를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신과 원성 국물 (LB) 한천 접시에 복구 문화의 100 μl를 확산하고 37 ° C에서 O / N을 배양한다. </li><li> 다음 날, 슈퍼 국물 (SB) 또는 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신 37 ° C에서 LB 한천 플레이트와 문화 O / N에서 한 식민지 포함하는 LB 문화의 6 ml에 접종. 주 : 콜로니 PCR 프라이머는 5 &#39;XmaI-EmGFP 및 3&#39;SacI로-EmGFP 미니 프랩을 사용하는 것은 이전에 양성 클론을 식별하는데 사용될 수있다. </li><li> 미니 프렙에 의하여 애완 동물-2F-ZIF-EmGFP을 정화하고 T7 프로모터를 사용하여 DNA 염기 서열에 의해 플라스미드를 확인 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;). </li></ol> 2. 발현 및 정제 <ol><li> 화학적으로 유능한 BL21 E.의 50 μl를 해동 얼음에 대장균 세포와 PL 애완 동물 2F-ZIF-EmGFP 100 NG로 가볍게 혼합asmid. 단계 1.7-1.8에 설명 된대로 변환. </li><li> 다음날, 단일 콜로니로 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 배지 10 ㎖에 접종하고 진탕하면서 37 ℃에서 O / N 성장. </li><li> 다음 날, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 0.2 % 글루코스 및 100 μM ZnCl이 보충 된 LB 배지 1 L로 O / N 배양의 10 mL로 희석. 0.8의 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도에 진탕 37 ° C에서 문화를 성장과 2 mM의 이소 프로필-β-D-1-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)와 단백질 발현을 유도한다. 4 ° C에서 10 분 동안 5,000 XG에 원심 분리하여 37 ° C에서 성장의 6 시간, 수확 세포 후. 참고 : 유도 조건이 매우 다양하고 표현되는 단백질의 안정성에 따라 달라집니다. 0.8 (600)에 도달 할 때까지 OD OD 600 매 30 분을 모니터링합니다. </li><li> 용해 완충액 5 ㎖ (50 mM의 트리스 -HCl, 500 mM의 염화나트륨에서 세포 펠렛을 재현 탁, 100 μM ZnCl 2, 1mM 디티 오 트레이 톨 (DTT), 1 ㎜의 MgCl 2, 1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF) 및 10 mM의 이미 다졸, pH를 8.0). 다음과 같은 설정으로 초음파에 의해 얼음에로 용해는 세포 : 50 % 전원 출력 / 10 초 오프 간격으로 5 초와 4 분의 처리 시간. 솔루션을 과열하지 마십시오. </li><li> 4 ° C에서 30 분 동안 25,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리기와 신선한 수집 관에 뜨는을 전송합니다. 최상의 결과를 위해, 4 ° C에서 다음의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 열 평형의 Ni-NTA 슬러리의 1 ml로 미리 포장을 통해 상층 액을 실행합니다. 세척 버퍼의 20 ㎖ (50 mM 트리스 - 염산, 500 mM의 NaCl을, 100 μM ZnCl 2, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 MgCl 2, 30 mM의 이미 다졸, 산도 8.0)와 수지 씻으십시오. </li><li> 5 용출 완충제 ㎖ (50 mM의 트리스 -HCl, 500 mM의 NaCl을 100 μM ZnCl 2, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 MgCl 2, 300 mM의 이미 다졸, pH를 8.0)으로 용출시켰다. </li><li> 버퍼 저장 버퍼와 용출 된 단백질 (50 mM의 교환트리스 -HCl, 500 mM의 NaCl을 100 μM ZnCl 2, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 MgCl 2, 10 % 글리세롤, pH를 8.0) 및 제조자의 지시에 따라 원심 분리하여 회전 농축기를 이용하여 적어도 40 μM로 단백질을 농축시켰다. </li><li> BCA 또는 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 결정합니다. 10 분 동안 95 ° C에서 2 μL 2 × SDS-PAGE 로딩 염료, 종기와 정제 된 단백질의 2 μl를 혼합 한 후 4 %에 단백질 순도 (그림 2) 평가 20 % 트리스 - 글리신 SDS-PAGE를 해결. </li></ol> 3. 단백질 저장 <ol><li> -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 농축 된 단백질, 플래시 동결 나누어지는. EmGFP 융합 단백질, 단백질 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 커버 튜브. </li><li> 반복 동결 단백질 용액의 해동을 피하십시오. 참고 : ZIF - 융합 단백질이 1 개월 이상 이러한 조건에서 안정하다. 부적절한 또는&gt; 4개월 스토리지 될 수 있습니다단백질 침전 또는 EmGFP의 광표백에. </li></ol> 4. 단백질 전달 <ol><li> 10 %를 함유하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 HeLa 세포를 유지 (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 항생제 - 항진균제 5 % CO 2와 완전히 가습 분위기에서 37 ℃. 참고 : 세포는 30 개 이상의 시간이 단백질 전달하지 않는 것이 좋습니다 계대. </li><li> 사전 코트 25 ° C에서 30 분 60에 대한 폴리 라이신의 50 μg의 / ㎖의 500 μL와 24 웰 플레이트. 웰 당 2 × 105 세포의 밀도로 24 웰 플레이트 상에 종자 세포. 세포가 80 % 사이에 -90 %의 합류 일단 파종 후 24 시간에서, 또는, 각 웰에서 미디어를 제거하고 예열 된 무 혈청 DMEM 500 μL (SFM)로 세척한다. </li><li> 각 웰에, SFM의 250 μL가 ZIF-EmGFP 단백질의 2 μM, 100 μM ZnCl 2를 포함하는 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. 참고 : ZIF 도메인은 세포를 입력 홍보imarily 에너지에 의존하는 메커니즘입니다 macropinocytosis, (34)를 통해. 따라서, 단백질의 효율적인 세포 내재화 37 ° C에서 배양해야한다. </li><li> 칼슘과 마그네슘이없는 500 μL로 3 회 세포에서 미디어를 제거하고 세척 둘 베코의 인산염 완충 식염수 헤파린의 0.5 ㎎ / ㎖로 보충 (DPBS). 참고 : 헤파린은 다운 스트림 분석을 복잡하게 할 수 표면에 결합 된 단백질을 제거 할 필요가있다. </li><li> 향상된 배달 3 회까지 (선택 사항) 반복 치료. </li><li> 바로 2 분 37 ° C에서 0.05 % 트립신 EDTA와 소화에 의해 세척 헤파린 후 처리 된 세포를 분리합니다. 1 % FBS가 보충 된 0.5 ㎖의 DPBS에서 분리 된 세포를 다시 일시. </li><li> 형광 염료 (FITC)의 채널 (도 3)을 이용하여 유세포 분석기 (35)에 의해 각 시료의 형광 강도를 측정한다. 의 인구를 배치 앞으로 분산 형 (FSC)와 측면 산란 (SSC)를 조정서로 다른 특성을 가진 집단이 서로 해결을 보장 규모에 관심. </li><li> 각 샘플에 대한 10,000 라이브 이벤트를 수집 및 처리 만 SFM 해당 셀에 ZIF-EmGFP로 처리 된 HeLa 세포로부터의 데이터 분석 소프트웨어. 36 정규화 유세포 형광을 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기, 세포 투과성 아연 손가락 (ZIF) 도메인을 사용하여 단백질 전달을위한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. ZIF 도메인 융합 효소화물 (34)의 활성을 감소시키지 않는다; 생산 및 수정되지 않은 단백질과 관찰 된 것과 거의 동일한 수익률 단백질의 정제 할 수 있습니다; 전통적인 세포 투과 펩티드 또는 단백질 전달체 시스템 효율성을 초과하여 세포 유형 내로 다양한 단백질 및 효소를 운반 할 수있다. 함께, 이러한 연구 결과는 다양한 유형의 애플리케이션에 직접 단백질을 세포 내로 전달을 매개하는 ZIF 도메인 넓은 전위를 나타낸다. 최대 단백질 전달은 이전보다 양전하를 운반 3-4 손가락 ZIF 도메인의 배열을 연장하는 사실에도 불구하고, 오직 두 손가락 ZIF 도메인을 사용하여 달성 하였다. 이러한 결과는 세포 - 매개 ZIF 항목 전하, INC 이외의 요인에 의해 영향을받을 수 있음을 나타낸다단백질 안정성 또는 구조적 강성을 luding. ZIF 도메인...

고효율 및 다양한 단백질 전달 전략은 많은 기초 연구 및 치료 응용 프로그램에 대한 중요합니다. 세포에 정제 된 단백질의 직접 배달이를 달성하기위한 가장 안전하고 가장 쉬운 방법 중 하나. 1, 2 핵산에서 유전자 발현에 의존하는 전략을 달리 표현, 3-5 단백질 배달에서 삽입 돌연변이 유발의 위험을 제기하지 무관 세포의 전사 / 번역 기계 및 즉각적인 효과를 할 수 있습니다. 그러나 단백질에 세포 침투 활동을 부여하는 대한 단순하고 일반화 방법의 부족은 정기적으로 세포에 직접적인 항목을 혼동. 단백질의 세포 내 전달을 용이하게하기위한 현재의 방법은 천연 또는 6-8 설계된 세포 침투 펩타이드 9-12 과급 전달 도메인, 13, 14 및 15 나노 리포좀 16 바이러스 입자 17,18 발생의 사용에 기초 </SUP&gt;과 고분자 미세 물질. (19) 불행하게도, 이러한 방법의 대부분이 낮은 세포 흡수 속도, 20, 21 가난한 안정성, (22) 실수로 세포 형 특이도, 23 낮은 엔도 좀 탈출 등록 (24)과 또한 독성. (25)에 의해 방해된다, 많은 ​​단백질 전달 기술은 전달 단백질의 생체 활성을 감소시킨다. (14) 우리 연구소는 이전에 아연 손가락 핵산 분해 효소를 증명 (ZFN) 단백질 - 키메라 제한이 프로그램의 Cys 2 - 그의 두 아연 손가락 DNA 결합 단백질과 FokI 제한 엔도 뉴 클레아 제 26 ~ 28의 절단 도메인으로 구성된 엔도 뉴 클레아 제 - 본질적으로 세포 - 아르 투과. (29)이 놀라운 세포 침투 활동은 맞춤 디자인 아연 손가락 도메인, 대상 게놈 엉위한 강력한 도구로 떠오르고있다 DNA 결합 플랫폼의 고유 재산 것으로 나타났다공학에, 30-32 간주은 단백질 표면에 양전하 여섯 잔기의 콘 스텔 레이션의 결과 일 수있다. 실제로, C 6 월 및 N-DEK 비롯한 여러 DNA 결합 단백질이. 세포막을 건너 타고난 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다 (33)은보다 최근에, 본 연구실은 이러한 결과를 확장하고 입증하는 아연의 셀 관통 활동 손가락 (ZIF) 도메인은 세포 내 단백질 전달을 위해 활용 될 수있다. 많은 기존의 세포 침투 펩타이드 전달 시스템을 초과 효율성을 빨아들이는 관 주도 특정 단백질화물에 1 또는 2 손가락 ZIF 도메인 중 하나의 유전자 융합. (34) 가장 주목할만한, ZIF 매개 배달 융합 효소화물의 활동을 손상시키고 용이하지 않았다 세포질 전달의 높은 수준. 종합적으로, 이러한 결과는 단백질의 효율적이고 용이 한 전달을 용이하게하기 위해 도메인의 ZIF 가능성을 입증하고, 매크로 잠재적으로보다 다양한 종류의세포에 분자. 여기, 포유 동물 세포에서 단백질 전달을위한 ZIF 기술을 구현하는 방법에 대한 자세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 우리는 이전의 제품군을 구성 액형, 2 차원, 3 ~, 네살, 다섯 자리와 여섯 손가락 인해 α 나선 DNA 결합 잔류 각각의 대체 선수로, DNA를 결합하는 능력이 부족 ZIF 도메인 만 셀 (34) (도 1)로 단백질을 제공 할 수있다. 두 손가락 ZIF 도메인을 이용하여 HeLa 세포에 GFP 에메랄드 (EmGFP)의 제작 및 형질 도입에 대해서 설명한다. 이 프로토콜은 대장균에서의 발현 및 수용성 거의 모든 포유 동물 세포 유형 가능한 거의 모든 단백질로 확장 가능하다. 예상되는 결과가 제공되며,이 시스템의 성능을 최대화하기위한 전략도 논의된다.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>고충실도 PCR 시스템 확장</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTP New</td><td>England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine Mini 단백질 젤, 1.5mm, 10웰</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli 샘플 버퍼</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 유능한 E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>염화아연</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 설페이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose 수지</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Flat Floor Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>폴리-라이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparan Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>나노 드롭 ND-1000 분광 광도계&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트,</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr>, <tr><td>QIAquick 겔 추출 키트,</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 투과성의 cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

모듈성과 광범위한 DNA 염기서열을 인식하도록 재프로그래밍할 수 있는 능력으로 인해 Cys2-His 2 zinc-finger DNA 결합 도메인은 표적 게놈 엔지니어링에 유용한 도구로 부상했습니다. 다른 많은 DNA 결합 단백질과 마찬가지로 아연 손가락도 세포막을 교차하는 타고난 능력을 가지고 있습니다. 우리는 최근에 이러한 내재적 세포 투과성이 세포 내 단백질 전달에 활용될 수 있음을 입증했습니다. 아연-손가락 모티프의 유전적 융합은 단백질과 효소 화물을 광범위한 포유류 세포 유형으로 효율적으로 운반합니다. 다른 단백질 transduction 기술과 달리, zinc-finger domain을 통한 전달은 효소 활성을 억제하지 않으며 높은 수준의 cytosolic delivery를 유도합니다. 여기에서는 포유류 세포로의 단백질 전달을 위한 아연 핑거 기술의 구현에 대한 자세한 단계별 프로토콜이 제시되어 있습니다. 높은 수준의 세포 내 아연-손가락 매개 전달을 달성하기 위한 주요 단계가 강조되고 이 시스템의 성능을 극대화하기 위한 전략이 논의됩니다.

두 손가락 ZIF-EmGFP 융합 단백질은 E.으로 표현 될 수있다 대장균&gt; 95 % 동질성과 높은 수율 (&gt; 25 ㎎ / ㎖) (그림 2). 일반적으로 단일 및 두 손가락으로 ZIF 융합 단백질은 야생형 변성 단백질의 것과 거의 동일한 양으로 제조 할 수있다. 그러나 어떤 상황에서, 다섯 자리와 여섯 손가락 ZIF 융합 단백질은 다운 스트림 응용 프로그램을위한 충분한 높은 수율로 제조 할 수 없습니다. 37 ° C에서 90 분 동안 HeLa 세포 상에 두 개의 손가락 ZIF-EmGFP 단백질의 직접 적용은 EmGFP 형광 (도 3A)에서 용량 의존적으로 증가를 이끈다. 결정적으로, 형광은 ZIF 도메인의 부재하에 관찰되지 않는다. 우리는 이전에 세포의 거의 100 %가 단지 2 μM 두 손가락 ZIF-EmGFP 단백질로 처리 한 후 형광성 관찰하고 ZIF 융합 단백질로 처...

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

본 절차의 전반적인 목표는 징크 핑거 도메인을 사용하여 녹색 형광 단백질과 같은 기능성 단백질을 포유류 세포로 전달하는 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 징크 핑거 도메인에 번역 융합된 에메랄드 녹색 형광 단백질 MGFP를 포함하는 발현 플라스미드를 제작합니다. 두 번째 단계는 박테리아에서 이 형광 융합 단백질을 발현시키는 것입니다.다음으로, 박테리아 세포를 용해하고 형광 융합 단백질을 정제합니다. 마지막 단계는 정제된 형광 융합 단백질을 포유류 세포와 함께 배양하여 단백질이 세포 내로 유입되도록 하는 것입니다. 최종적으로, 처리된 세포의 형광을 유세포 분석법으로 정량화하여 세포 내로의 융합 단백질 전달 효율을 결정할 수 있습니다.Thief 또는 HIV 유래 tight 펩타이드나 poly arginine과 같은 다른 단백질 전달 도메인의 주요 장점은, 탑재된 효소 화물의 활성을 저해하지 않으면서 높은 수준의 세포질 전달을 촉진할 수 있다는 점입니다. PCR을 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 플라스미드로부터 emerald GFP 또는 MGFP 서열을 증폭하십시오. 젤 추출 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제한 다음, 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 정량하십시오. 다음으로, alanine 서열을 포함하는 PET 28 발현 벡터를 준비하십시오.두 개의 핑거, 아연 핑거 또는 두 개의 FZ 도메인 소팅 벡터와 MG F-P-P-C-R 산물을 XMA 1 및 SAC 1 제한 효소를 사용하여 DNA µg당 10 unit의 효소 농도로 처리하고, 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 겔 추출법으로 DNA 단편을 정제하고 벡터와 MG F-P-P-C-R 산물의 농도를 측정합니다. 분광광도계를 사용하여 MG F-P-P-C-R 산물과 50 내지 100 ng의 벡터를 삽입물 대 벡터 몰비 6:1로 하나의 튜브에 혼합합니다.그 다음 T4 DNA ligase 1 unit을 첨가하고, 결합된 플라스미드로 박테리아를 형질전환시키기 위해 상온에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 화학적 컴피턴트 E. coli 세포 50 µL 분주액을 얼음 위에서 해동합니다. 그 후 세포를 결합된 DNA 10~20 ng과 부드럽게 혼합하고, DNA와 함께 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.배양 후, 세포를 42 °C에서 90초 동안 열충격 처리합니다. 튜브에 2 mL의 SOC 배지를 추가하고, 형질전환체를 선택하기 위해 37 °C에서 1시간 동안 진탕 배양하여 세포를 회복시킵니다. 50 µg/mL의 kanamycin이 함유된 LB agar 플레이트에 배양액 100 µL를 도말하고, 다음 날까지 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.50 µg/mL의 kanamycin이 함유된 6 mL LB 배지에 하룻밤 동안 배양한 플레이트에서 분리한 단일 콜로니를 접종합니다. 해당 배양액을 37 °C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 세포를 수확하여 mini prep을 통해 플라스미드를 분리하고, 프라이머를 이용한 시퀀싱으로 플라스미드를 확인합니다.T7 프로모터의 경우, 플라스미드는 MGFP에 대한 두 FZ 도메인의 N-말단 번역 융합체를 포함해야 합니다. 단백질 정제를 시작하기 위해, 먼저 정제된 플라스미드 100 nanograms를 BL 21 equalize 세포에 형질전환합니다.다음 날 can mycin이 함유된 LB agar에서 형질전환체를 선별하십시오. overnight 플레이트의 단일 콜로니를 can mycin이 함유된 10 mL LB 배지에 접종하고, 37 °C에서 shaking 하며 overnight 배양하십시오. 배양된 전체 콜로니를 can mycin, 0.2% glucose 및 100 µM zinc chloride가 첨가된 1 L LB 배지에 희석하십시오. 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.8에 도달할 때까지 37 °C에서 shaking 하며 배양한 후, 발현을 유도하기 위해 IPTG를 최종 농도 2 mM이 되도록 첨가하십시오. 유도 후 6시간이 지나면, 4 °C에서 5,000 ×g로 10분간 원심분리하여 세포를 수확하십시오.세포 펠릿을 5 mL의 용해 버퍼에 재부유시킨 후, 50% 출력과 5초 작동 및 10초 정지 사이클을 사용하여 4분 동안 얼음 위에서 초음파 처리하여 세포를 용해합니다. 다음으로, 세포 용해물을 4 °C에서 25,000 ×g로 30분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 얼음 위에 놓인 새로운 수집 튜브로 옮깁니다. 단백질을 정제하기 위해, 1 mL의 니켈 니트릭 아세트산 슬러리가 미리 충전된 컬럼에 상층액을 로딩합니다.상층액을 컬럼에 통과시킨 후, 20 milliliters의 세척 버퍼로 레진을 세척합니다. 5 milliliters의 용출 버퍼로 컬럼에서 단백질을 용출시킨 다음, 해당 용액을 투석 튜브로 옮겨 단백질과 보관 버퍼를 하룻밤 동안 투석합니다. 스핀 농축기를 사용하여 3000 ×g에서 1시간 동안 원심 분리함으로써 단백질을 최소 40 micromolar로 농축합니다.보관을 위해 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 단백질 농도와 순도를 측정하십시오. 1.5 mL 원심분리 튜브에 단백질 200 µL를 분주하고, MGFP 융합 단백질의 광퇴색을 방지하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸십시오. 그다음 단백질을 액체 질소에서 급속 냉동하고 -80 °C에서 보관하여 단백질 형질도입을 준비하십시오. 먼저 24-웰 플레이트의 웰에 50 µg/mL 용액 500 µL로 프리코팅하십시오.25°C에서 30분에서 60분 동안 Polylysine으로 처리합니다. 세포 배양물을 접종하기 전 웰에서 용액을 흡입하여 제거합니다. 10% FBS와 1% antibiotic anti mycotic가 포함된 DMM에서 5% carbon dioxide가 공급되는 37°C 습윤 배양기 내에 세포를 배양합니다.세포를 수확하여 24웰 플레이트에 웰당 200,000 cells의 밀도로 분주합니다. 그 후 약 24시간 동안 배양하여 세포 밀도가 80~90%로 합쳐졌을 때 24웰 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 각 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고, 미리 데워둔 500 µL의 무혈청 배지 또는 SFM으로 세포를 세척합니다.2 µM Z-M-G-F-P 단백질과 100 µM 염화 아연이 포함된 SFM 250 µL를 각 웰에 첨가한 후, 세포를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 0.5 mg/mL의 헤파린이 보충된 칼슘 및 마그네슘 제거 더코스 인산염 완충 식염수(DPBS) 500 µL로 세포를 3회 세척합니다. 이어서, 0.05% trypsin EDTA 200 µL를 웰에 첨가하고 37 °C에서 2분 동안 배양하여 세포를 플레이트에서 분리합니다.분리된 세포를 새 튜브로 옮기고 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 1% FBS가 첨가된 500 mL의 DPBS에 세포를 재현탁하고, 이전에 설명한 대로 FITC 채널을 사용하여 유세포 분석법으로 시료의 평균 형광 강도를 측정합니다. 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter)을 조절하여 관심 세포군이 스케일 안에 위치하도록 설정합니다.다음으로, 설정된 게이팅을 사용하여 대조군 및 테스트 샘플을 분석합니다. 샘플당 10,000개의 살아있는 세포를 수집하고 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다. 단백질 처리 세포의 형광 강도를 대조군 혈청 처리 세포에 대해 정규화합니다.Zif MGFP 융합 단백질을 E. coli에서 생산하여 정제한 후 SDS PAGE로 분석하였습니다. 분석 결과, 두 개의 핑거를 가진 ZIF MG FP 융합 단백질이 95% 이상의 균질도로 정제되었음을 확인하였습니다. HeLa 세포에 ZIFF MG FP 융합 단백질을 농도별로 처리했을 때,유세포 분석법으로 측정한 결과, 평균 형광 강도가 농도 의존적으로 증가하는 것이 나타났으며, 2 µM 농도의 Z MG FP 융합 단백질로 연속 처리했을 때 세포의 거의 100%에서 MGFP 형광이 관찰되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 기능성 단백질을 세포 내로 전달하기 위해 단백질 투과 도메인을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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생물학

단백질 전달은 세포에 생물학적으로 활성화된 단백질의 직접 배달을 수 있습니다. 이러한 DNA의 transfection 또는 바이러스성 도입으로 종래의 방법과는 달리이 비침습 패러다임은 세포 독성 및 영구 유전자 조작에 의해 종양 발생 변화의 위험을 우회 titratable 방식으로 고효율 세포 조작이 가능합니다.

공학 세포 투과 단백질

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

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이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

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적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

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식물 수정을 위한 기존 방법은 적용 가능성이 제한적입니다. 여기에서 제안된 새로운 펩타이드 유래 기술은 온전한 식물의 원하는 세포 내 구획에 외인성 단백질 또는 유전자를 도입하는 데 있어 단순성과 효율성을 모두 약속합니다.

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이것은 세포내 단백질 단백질 상호 작용 세포 관통 시퀀스 결합의 참신과 함께 biotin avidin 풀 다운 시스템에 기초를 공부 하는 프로토콜 이다. 주요 장점은 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 대상 시퀀스를 incubated 하 고 따라서 상호 작용 세포 컨텍스트 내에서 발생 합니다.

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배우세요 아연 손가락 도메인을 이용한 포유 동물 세포 내 단백질 전달 방법을. 이 프로토콜은 플라스미드 생성, 대장균 발현, 단백질 정제 및 세포 투과 과정을 포함하며, 유세포 분석으로 전달 효율을 정량화합니다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달

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