인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

이 절차의 전반적인 목표는 인두 중배엽에서 심장 및 근육 전구 세포의 유지, 이동 및 운명을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 갓 채취한 쥐 배아에서 인두궁을 해부함으로써 이루어집니다. 다음으로, 아치는 부착을 용이하게 하기 위해 미디어 필름에 배치됩니다.

그런 다음 인두 엑스플랜 내부 또는 인두 익스플랜에서 이동하는 세포를 매일 모니터링합니다. 궁극적으로, Cree 기반 형광 계통 추적은 인두궁 내에서 심장 및 근육 전구 세포의 이동 분화 및 재생을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 심장 또는 근육 전구 세포의 갱신 개체군과 그 미세환경을 in vitro에서 연구하기 위한 유일한 생체 외 시스템이라는 것입니다.

9.5일 된 생쥐 배아의 부모 아치는 크기가 2-300마이크로미터에 불과하여 사전 시각화 없이는 식별하고 해부하기가 매우 어렵기 때문에 이 방법을 입증하는 것이 중요합니다. 절차를 시작하기 전에. Coda 12, 10% FBS가 보충된 PBS가 있는 웰 플레이트.

1시간 후, 코팅 용액을 웰당 200마이크로리터의 무혈청 배지로 교체합니다. 매체 필름이 웰 바닥의 전체 표면을 덮도록 플레이트를 소용돌이치게 합니다. 다음으로, 안락사된 임신한 쥐의 배에 70% 에탄올을 뿌리고 청소합니다.

그런 다음 멸균 도구를 사용하여 해군 부위를 0.5cm 절개합니다. 절개 부위의 위와 아래 피부를 잡고 반대 방향으로 부드럽게 당깁니다. 그런 다음 배꼽에서 복부 양쪽의 난소까지 막을 V자 모양으로 절개하여 자궁을 드러냅니다.

집게로 자궁과 난소를 연결하는 난관을 꼬집고 가위로 난소 쪽의 난관을 꼬집어 자궁에서 자궁을 빼냅니다. 요식이핵으로 자궁을 부드럽게 끌어올립니다. 방광 부위에서 자궁을 잘라냅니다.

그런 다음 자궁을 uct로 더 위로 당기고 반대쪽의 UCT를 잘라 복강에서 자궁을 분리합니다. 칼슘과 마그네슘이 함유된 20ml의 차갑고 멸균된 PBS가 들어 있는 50ml 튜브로 자궁을 옮깁니다. 튜브를 10초 동안 부드럽게 흔들어 혈액을 씻어냅니다.

그런 다음 집게를 사용하여 자궁을 10ml 접시에 옮기고 조직에 5ml의 차가운 PBS를 추가합니다. 그런 다음, 실체 현미경으로 두 쌍의 집게를 사용하여 자궁을 부드럽게 열고 배아가 들어 있는 양막을 한 번에 하나씩 해부합니다. 그런 다음 각 배아에 대해 차례로 한 쌍의 집게로 양수 자루를 꼬집어 부드럽게 제거하고 다른 쌍을 사용하여 배아에서 자루를 자르고 풀어냅니다.

배아를 옆으로 눕히고 집게를 사용하여 첫 번째와 두 번째 아치를 아치와 인두 주머니 사이의 심장 뒤쪽으로 자릅니다. 배아를 뒤집어 반대쪽의 아치를 자른 후 시연됩니다. 아치와 배아를 연결하는 심장 유출로를 절단하고 제거합니다.

나머지 심장 유출관과 4개의 장 내배엽에서 두 개의 인두궁을 각각 꼬집었다 놓습니다. 차례로, 조직을 코팅된 12웰 플레이트의 개별 웰 중앙으로 옮기고 아치가 매체로 덮이지 않도록 주의합니다. 부착을 용이하게 하려면 세포 배양 조건에서 아치를 배양합니다.

2시간 후, 섭씨 37도의 혈청이 없는 배지 200마이크로리터를 우물 측면에 넣고 아치가 부착된 상태로 유지되도록 주의하고 밤새 조직을 배양합니다. 다음날 아치가 여전히 부착되어 있음을 육안으로 확인했습니다. 그런 다음 섭씨 37도의 무혈청 배지 200마이크로리터를 웰에 부드럽게 추가합니다.

조직이 분리되어 뜨기 시작하면 미디어 필름만 남을 때까지 아치를 제거하지 않고 피펫으로 매체를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 아치를 웰 중앙으로 다시 이동하고 조직을 다시 배양합니다. 이틀에 한 번씩 현상 중에 증발된 매체를 100-200마이크로리터의 신선한 배지로 교체하십시오.

안면 근육과 심장 전구 세포는 증식하고 첫 번째 인두궁과 두 번째 인두궁에서 이동하여 각각 머리와 심장 근육이 되는 과정을 추적할 수 있습니다. 인두궁을 배양하는 것은 생체 외에서 심장과 근육 발달을 자세히 연구할 수 있는 독특한 방법을 제공합니다. CRE 잠금 시스템을 사용하여 36 - 72시간에 생체 외 배양 후 24-48시간 이내에 Cree 발현에 대해 형광 리포터가 마우스 중배엽 자손을 추적할 수 있습니다.

심근세포 형성은 두 번째 궁 내에서 이동하는 세포의 군집을 자발적으로 수축하고 특정 심근세포 마커를 분석하여 시각적으로 확인할 수 있습니다. 3일에서 7일간의 배양 후, 근육관과 안면근육 형성은 첫 번째 궁 내에서 길쭉하고 자발적으로 경련하는 세포로 시각화할 수 있으며, 발달 후 특정 근육 마커를 분석하여 시각화할 수 있습니다. 이 기술은 심장 및 근육 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 체외에서 확장되는 전구세포와 그 틈새를 직접 모니터링하고 연구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 쥐 배아 발달에서 foral arch를 해부하는 방법과 심장 및 근육의 생식 발달을 생체 외에서 연구할 수 있는 배양 in vitro로 해부하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.