등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서

이 비디오 기사는 췌관 선암에서 등쪽 뿌리 신경절(DRG)/암 세포 모델의 사용을 보여줍니다.

이 모델의 전반적인 목표는 암성 신경 미세환경을 다시 요약하는 것입니다. 이를 통해 암세포 뉴런 상호작용을 탐색할 수 있습니다. 이 방법은 종양 세포와 뉴런 간의 상호 작용 및 각 세트의 상호 영향과 같은 종양 미세환경 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 신뢰할 수 있고 수행하기 쉽고 신경 틈새의 세포 및 대뇌 요인을 모두 해결할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 암 발달 전반에 걸쳐 신경 리모델링 및 침습 과정의 핵심 요인에 대한 치료 개발 및 약리학적 표적화로 확장됩니다. CO2 챔버에서 동물을 안락사시킨 후 털을 70% 에탄올에 담그고 건조시킵니다.

마우스를 엎드린 자세로 고정한 다음 뒤쪽 목에서 요추까지 두개골 꼬리로 확장되는 정중선 절개를 만듭니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 진피 피판을 양측으로 들어 올리고 피하 조직을 노출시킵니다. 두개경부 접합부가 확인될 때까지 쥐의 두개골을 촉진합니다.

동물과 수직으로 기울어진 가위를 사용하여 두개경부 접합부에서 경추 근육과 척추를 절단합니다. 그런 다음 척추를 꼬리 쪽으로 절개하고 가위를 사용하여 다섯 번째 요추에서 완전한 꼬리 절개를 수행합니다. 그런 다음 마우스를 누운 자세로 놓고 목에서 복부까지 정중선을 따라 절개 한 후 피부를 측면으로 수축시킨 다음 복막을 잘라냅니다.

두개골적으로 가위로 흉벽을 엽니다. 복막장기와 후복막장을 제거한 후 집게와 수술용 칼날을 사용하여 갈비뼈를 자르고 척추에서 약 5mm의 갈비뼈를 남깁니다. 신체의 나머지 부분에서 척추를 제거합니다.

그리고 차가운 PBS로 두 번 씻으십시오. 4X 배율이 장착된 실체 현미경 아래에서 비접착성 흡수 플랫폼에서 동일한 두개골 방향으로 척추를 위로 향하게 배치합니다. 이 실체 현미경을 통해 보면서 척추 근육과 결합 조직을 제거하십시오.

갈비뼈는 척추를 떠날 때 신경의 랜드마크로 사용하십시오. DRG는 경추, 흉추 및 요추에 위치합니다. 가위를 사용하여 척추체의 정중선을 절단하여 척수에 창을 만든 다음 척체를 부드럽게 집어넣어 척수와 DRG 뿌리를 노출시킵니다.

그런 다음 스프링 가위를 사용하여 위쪽 갈비뼈를 제거하여 DRG를 노출시킵니다. 갈비뼈 측면을 따라 DRG의 내측으로 말초 신경을 따릅니다. 신경에 놓여 있는 계란 프라이의 노른자처럼 보이는 것으로 묘사될 수 있는 DRG를 식별합니다.

DRG 원위부의 늑간 신경을 절단하고 신경절 원위부에 2-3mm의 신경을 남겨 수축에 사용합니다. DRG를 꼬집거나 손상시키지 않도록 집게를 사용하여 원심성 신경을 조심스럽게 잡습니다. 이제 신경을 옆으로 당겨 DRG를 부드럽게 후퇴시킵니다.

그런 다음 DRG에 가까운 전치근과 후치근을 자릅니다. 분리된 DRG를 얼음처럼 차가운 DMEM으로 채워진 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 층류 후드에서 작업하면서 얼음 위의 종이 격자 위에 35mm 유리 바닥 페트리 접시를 놓습니다.

사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 그리드 중앙에 약 10마이크로리터의 성장 인자 고갈 ECM을 분배합니다. 동안 view2-4X 배율로 실체 현미경을 통해 접시를 보고 DRG를 접시 바닥에 가까운 ECM 중앙에 놓습니다. 채취 및 세척 후 40, 000 confluent culture에서 관심 암 세포가 펠릿과 40 마이크로 리터의 ECM을 얼음에 재현탁시킵니다.

다시 한 번, 실체 현미경을 통해 그리드를 보고, DRG에서 500미크론을 측정하고, 이 시점에서 10마이크로리터의 세포 현탁액을 분배합니다. DRG에서 모든 방향으로 반복합니다. 접시를 층류 후드에 10-15 분 동안 그대로 두어 굳히되 마르지 않도록합니다.

ECM이 응고되면 플레이트의 측벽에 피펫팅하여 보충된 DMEM을 천천히 추가합니다. ECM을 덮을 수 있을 만큼 약 2mL의 매체를 추가합니다. DMEM의 추가는 플레이트 바닥에서 DRG가 분리되지 않도록 플레이트의 측벽에 피펫팅하여 매우 천천히 수행해야 합니다.

조직 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓고 프로토콜의 서면 부분에 있는 지침을 따라 배양을 유지합니다. 이 현미경 사진은 시딩 후 0일차에 시야 상단의 DRG와 시야 하단의 암세포를 보여줍니다. 여기에서는 파종 후 7일 후에 동일한 배양물을 보여줍니다.

화살표로 표시된 것처럼 암세포는 DRG 뉴런을 따라 이동합니다. 이 히스토그램은 다양한 유형의 암세포에 대한 DRG 신경 침습 지수를 보여줍니다. Kpc 989 세포와 MiaPaCa 세포는 QLL2 또는 NIH3T3 세포보다 신경 침습 지수가 높다는 것을 알 수 있습니다.

이 좌표 그래프는 빨간색으로 표시된 신경과 접촉하는 Kpc 암 세포와 자주색으로 표시된 QLL2 세포의 이동 경로를 보여줍니다. X 및 Y 좌표가 표시됩니다. 이 그림은 축삭 접촉으로 QLL2 암세포를 이동시키기 위한 원점에서의 분석을 보여줍니다.

여기서 Kpc 암세포의 기원 거리는 다음과 같습니다. 각각의 경우에서, 이동의 방향은 신경절 쪽이었다. 이 절차를 시도하는 동안, 체크율이 100%가 아니기 때문에 필요한 것보다 더 많은 신경절을 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후, DRG 동기는 암 연구 분야의 연구자들이 종양 미세환경 내의 신경 틈새를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 DRG와 같은 해부학적 랜드마크를 인식하는 방법, DRG를 추출하는 방법, 마지막으로 DCM에서 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 암세포와 함께 DRG의 공동 배양도 제시됩니다.