Name: 등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 배우세요 등쪽 뿌리 신경절과 암세포 공배양 모델을 이용한 신경 미세환경 재현 기법입니다. 이 방법은 췌관선암에서 암세포와 신경원 상호작용을 연구하고 표적 치료 개발에 활용됩니다.

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Edith Suss-Toby는 타임랩스 현미경 및 이미지 분석에 도움을 준 것에 대해 감사를 표합니다. Nofar Rada는 예술적 작업에 대해 감사를 표합니다.

6 주 된 여성 C57BL / CJ 마우스에 네살 (할란은, 예루살렘, 이스라엘) 평가 및 실험 동물 관리 사양의 인증을위한 협회에 따르면 실험에 사용 하였다. 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 농업 규정의 부에 따라 수행 하였다. 1. 수확 척수 <ol><li> 공동이 챔버를 사용하여 마우스를 안락사. 이 전단력에 의한 신경절 뿌리에 손상을 줄 수 있습니다로 자궁 전위를 피하십시오. 여기부터, 멸균 조건에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 동물을 담근다. 이 단계는 살균 및 내부 기관을 통해 끌어으로부터 모발을 방지하는 것이 중요하다. </li><li> 에탄올 건조 마우스를 둡니다. 신경 독성에 의한 내부 장기와 에탄올의 접촉을 방지합니다. </li><li> 마우스를 건조시킨 후,하기 쉬운 위치에 핀을 사용하여 위치(면 아래로). 각각의 뒷다리와 앞다리의 핀을 배치합니다. </li><li> 집게를 사용하여 요추의 후방 목 craniocaudally 연장하는 중간 선 절개를합니다. 다음, 집게를 사용 양자 피부 플랩을 올리고 피하 조직을 노출. </li><li> craniocervical 접합에 도달 할 때까지 마우스 두개골을 만져. 무거운 집게를 사용하여 craniocervical 접합 (7 번째 경추)에서 자궁 근육과 척추를 잘라 동물, 수직 가위를 사용하여. 꼬리 쪽 척추를 해부 및 요추 수준 (뒷다리 레벨)에 도달 할 때까지 무거운 집게로 척추를 절제. </li><li> 무거운 집게를 사용하여 요추 수준 (5 번째 요추 척추)에서 완벽한 꼬리 절개를 수행합니다. </li><li> (직시) 마우스를 롤오버. DRG는 자궁을 하부 척추 레벨에서 추출되어 있지 않기 때문에 절개를 커버 할 필요는 없다. </li><li> 복부에 목의 중간 선에서 삭감의 철회피부는 측면 후 복막을 엽니 다 잘라. </li><li> 일괄 복막 내부의 내부 장기 (간, 비장, 췌장, 위, 그리고 소장)를 제거합니다. 다음으로, 복막 기관 (즉, 신장 및 췌장)를 제거합니다. 두개쪽으로는 가슴 벽을 엽니 다. </li><li> 집게 및 수술 블레이드를 사용하여, 양자 떨어져 척추에서 갈비의 5mm를 떠나, 갈비뼈를 잘라. 이때, 척추가 몸의 나머지로부터 분리된다. </li><li> 두 번 감기 (4 °에 C) 신선한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 혈액의 척추을 씻으십시오. </li></ol> 2. 격리를 등쪽 뿌리 신경절 (DRG) <ol><li> 4 배의 배율을 가진 실체 현미경을 사용합니다. </li><li> 비 부착 비 흡수 플랫폼 (Telfa / 나일론)에 척추를 놓습니다. 같은 부교감-꼬리 방향에서 척추의 얼굴을 놓습니다. </li><li> 모든 척추 근육과 결합 조직을 제거합니다. 그들은 같은 신경 랜드 마크로서 리브를 사용하여척추를 둡니다. 리브는 수술 도구에서 신경을 보호합니다. DRG는 척추의 경추, 흉추, 요추 사이트에 있습니다. </li><li> 다음으로, 사용 가위는 중간 선에서 척추 몸을 절감하고 척추 신체의 부드러운 측면 후퇴하여 척수 및 DRG 뿌리를 노출합니다. </li><li> 늑간 공간에서, DRG에 리브 측면을 따라 내측 주변 신경을 따르십시오. </li><li> DRG를 확인합니다. 그것은 신경에 누워 &#39;기름에 튀긴 된 계란&#39;의 노른자처럼 보인다. </li><li> 신경절에 신경 말단의 2-3mm 떠나 DRG에 늑간 신경 말단을 잘라 후퇴에 사용합니다. 이 &quot;꼬리&quot;수확 후 제거됩니다. </li><li> 집게를 사용하여 신경을 잡고. DRG 본체 자체를 곤란하게하는 신경 세포 손상의 원인이됩니다 피해야한다. </li><li> 그 전방 및 후방 뿌리를 통해, 근위 척수에 첨부 파일을 따라 DRG 접근. </li><li> EF의를 당겨 DRG에 부드러운 철회를 적용ferent 신경 (늑간 신경 루터) 측면 및 DRG에 가까운 전방 및 후방 뿌리를 잘라. </li><li> 10 % 소 태아 혈청 (FCS)이 보충 된 신선한 빙냉 DMEM, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 % 비 필수 아미노산, 1 % 나트륨 피루 베이트로 가득 35mm 페트리 접시에서 DRG 유지. </li></ol> 페트리 접시 3. 주입 <ol><li> ECM의 응고를 방지하기 위해 사전 냉각 피펫 팁을 사용하여 얼음에 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 2-4X 배율의 실체 현미경에서 종이 그리드에 35mm의 유리 바닥 배양 접시를 놓습니다. 중요 : 액체 상태의 ECM을 유지하기 위해 얼음 작업. 격자의 중심에서 성장 인자 제거 된 ECM을 1mm 직경의 스폿 (약 20 μL)을 만든다. </li><li> 직접 시각화 하에서, 접시의 바닥에 가까운 ECM 스폿의 중심에 DRG를 배치했다. 주 :이 프로토콜에서 사용하는 암 세포는 뮤린 췌장암 세포 (KPC) establis다른 곳에서 19 설명 된대로 KPC 쥐에서 갓 격리 된 종양 표본에서을 hed. </li><li> 융합 문화에서 수확 40,000 암 세포는 PBS로 한번 씻어, 얼음에 40 μL의 ECM에서 그들을 재현 탁. </li><li> DRG에서 각 방향에서 입체 측정 500 μm의를 사용하여 그리드의 직접 시각화에서. 이 시점에서 천천히 10,000 세포 / 10 ㎕의 ECM을 시드. 행렬의 행렬 또는 분리 자신의 확산을 방지 접시 바닥에 가까운 세포를 주입하는 2-10 μl의 예비 냉각 팁을 사용합니다. (그림 1). </li><li> 응고하기 10 ~ 15 분 동안 층류 후드 내에서 접시를 남겨주세요. ECM 건조하지 마십시오. </li><li> 천천히 플레이트의 측벽에 대하여, 앞서 언급 한 바와 같이 제조 된 DMEM을 추가한다. 전자 재료 (약 2 ㎖)에 충분한 매체를 추가합니다. </li><li> 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 접시를 넣습니다. </li><li> 다음 날에 신선한 매체와 매체를 교체합니다. </li><li> 2 일마다 배지를 교체합니다. &lt;/ 리&gt; </ol> 4. 데이터 수집, 시간 경과 Videomicroscopy <ol><li> 이식 후 7 일째에, 시간 경과 현미경을위한 요리를 취할. 특정 세포로 인해 빠르게 마이그레이션 이전에 획득을 필요로 할 수 있습니다. </li><li> 라이브 이미징 동안 37 ± 0.1 ° C, 5 % CO 2의 평균 온도에서 폐쇄 된 환경에서 접시를 놓습니다. </li><li> 현미경에 배치 된 전하 결합 소자 카메라를 사용하여 셀을 기록한다. </li><li> 3 ~ 6 가지 세포에서 세포 운동을 수행하는 72 시간까지에 대한 디지털화 된 이미지마다 10 분 가져 가라. </li><li> 24 시간 후 배지를 교체합니다. </li><li> 데이터 수집 및 현미경 소프트웨어를 이용하여 간단한 분석을 수행한다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 고급 응용 프로그램 (즉, 2D 또는 3D 세포 추적) (예 : Imaris 4D 등) 전문 소프트웨어를 사용하십시오. 참고 :이 소프트웨어에서 셀의 XY 좌표를 결정한다모든 움직임의 원점으로부터의 거리, 및 속도와 함께, 시간 지정. </li><li> 10 분 간격으로 연속적인 위치 사이의 주행 거리를 측정하여 평균 속도를 계산한다. 신경 돌기의 셀 전면의 거리이며 DRG 향한 세포의 방향성 움직임을 설명하는 전달 마이그레이션 지수 (FMI)를 계산한다. </li></ol>

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</ol>

이 연구는 ICRF Barbara S. Goodman 기부 연구 경력 개발상(2011-601-BGPC)과 미국-이스라엘 이국적 과학 재단의 보조금의 지원을 받았습니다. 저자로부터 다른 재무 공개는 이루어져서는 안 됩니다.

이 문서에서는 신경 틈새에서 암의 미세 환경의 DRG 모델을 되풀이되었습니다 체외 모델을 제시한다. 비디오는 같은 마우스에서 DRG, 그 추출 및 ECM의 마지막으로, 그 배양으로 해부학 적 랜드 마크를 인식에서 시작하여 모든 단계를 보여줍니다. 공동 배양 암세포 나란히 DRG 또한 제공된다. 체외에서 신경초 틈새 미세 환경 연구를위한이 모델은 필수적 만드는 문헌에 기재된 체외 신경초 침윤 연구를위한 다른 모델이 없습니다. 비디오에 제시된 프로토콜은 두 가지 중요한 단계가 있습니다. DRG 본체 (프로토콜의 단계 2.7)에 인접한 신경을 파악 첫째,주의를 기울여야합니다. 파악 또는 DRG 곤란하면 DRG에 돌이킬 수없는 기계적 또는 허혈성 손상이 성장하고 페트리 접시에 시드 때 돋아에서 방지 될 수 있습니다. 두번째 중요한 단계이다 주입전자 재료 내부의 페트리 접시에 암세포. 천천히 그리고 신중하게 세포를 배정하는 세포의 부동과...

직접 침윤, 림프 확산 및 hematogenic 확산 : 고체 종양은 세 가지 방법으로 전파. 그러나, 자주 신경을 따라, 보급을 무시 암 확산의 제 4 수단이있다. 암성 신경 침윤 (CNI)는 특히 두경부 1 전립선 2, 3 및 췌장 암의 암 확산의 공지의 경로이다. 4-8 CNI 선도 췌장 선암 개인의 80 % 이상에서 발생 복강 신경절 신경을 통해 확산 복막 종양. 이러한 neurotropic 암 세포는 중추 신경계 (CNS) 방향으로 신경을 따라 일방향으로 이주 할 수있는 독특한 능력을 가지고있다. (9)이 결과는 신경초 미세이 악성 성장을 지원하는 인자를 제공하는, 암 세포에 의해 이용 될 수 있다는 것을 시사한다. CNI 연구를위한 몇 체외 모델 중 하나는 후근 신경절 (DRG) / 암 세포 모델입니다. 이 모드엘 자주 갓 해리 배양 DRG의 준비에 인접한 세포 외 기질 (ECM)에서 재배되는이 모델, 마우스 또는 인간의 암 세포 라인에 신경 기질 암 세포 사이. 10-18 분비의 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 이 비디오 기사는 췌장 도관 선암에서 체외 CNI의 응용 프로그램을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td><강한>장비:</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>운영 현미경</td><td>Leica</td><td>M205</td><td></td></tr><tr><td>타임랩스 시스템</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>수술용 칼날</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z309036</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271</td><td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시, 유리 바닥</td><td>de groot</td><td>60-627860</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Materials:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜드 PBS</td><td>생물학 산업</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>생물학 산업</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>레늄</td><td>10108165</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>생물학 산업</td><td>01-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>생물학 산업</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>생물학 산업</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>성장 인자 고갈 마트리겔</td><td>트레비겐</td><td>3433-005-01</td><td></td></tr></tbody></table>

등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

고형 종양이 퍼지는 한 가지 방법은 신경 침입을 통해서입니다. 이 경로는 두경부암, 전립선암, 췌장암에서 잘 알려져 있다. 이 신경성 암세포는 신경을 따라 단방향으로 중추신경계(CNS)로 이동하는 독특한 능력을 가지고 있습니다. 등뿌리신경절(dorsal root ganglia, DRG)/암세포 모델(cancer cell model)은 신경질세포와 암세포 사이의 상호작용을 연구하는 데 자주 사용되는 3차원(3D) 체외 모델입니다. 이 모델에서는 마우스 또는 인간 암 세포주가 갓 해리된 배양 DRG의 제제에 인접한 ECM에서 성장합니다. 이 기사에서는 생쥐의 DRG 분리 프로토콜과 췌장암 세포와 공동 배양을 위해 페트리 접시에 이식하는 방법을 보여줍니다. 이식 5일 후, 암세포는 DRG 신경돌기와 접촉했습니다. 나중에, 이 세포들은 암세포의 더 광범위한 편광, 신경자극성 이동을 촉진하기 위해 교두보를 형성했습니다.

<html> 비디오 현미경 영상을 사용하여, DRG는 암세포가 DRG에 대한 그들의 콜로니로부터 멀리 이주 동안 주입 후 신경 돌기 5-7 일간 발아 알 수있다. 이식 후 7 일째에 의해, 암 세포는 신경 돌기 (도 2)와 접촉. 이 프로토콜에서 사용되는 췌장암 세포의 전방 이동 지수는 다른 세포주 (QLL2, B16F) (도 3a)보다 배 이상 3-4이다.도 3B는 대표적인 X 제시 도표와 Y는 이동 경로를 나타내는 그래프 좌표 신경 접하는 KPC 암 세포; 저속 videomicroscopy 분석은 KPC 세포 및 비 침략 세포 (도 3C-D) 사이의 전방 이동의 차이가 아니라 속도를 보여 ...

이 비디오 기사는 췌관 선암에서 등쪽 뿌리 신경절(DRG)/암 세포 모델의 사용을 보여줍니다.

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

이 모델의 전반적인 목표는 암성 신경 미세환경을 재현하는 것입니다. 이를 통해 암세포와 뉴런 간의 상호작용을 탐구할 수 있습니다. 이 방법은 종양 세포와 뉴런 사이의 상호작용 및 각 집단이 서로에게 미치는 영향과 같이 종양 미세환경 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 신뢰도가 높고 수행하기 쉬우며, 신경 니치(neural niche) 내의 세포 및 뇌 요인을 모두 다룰 수 있다는 점입니다. 이 기술의 활용 범위는 암 발생 과정 전반에 걸쳐 신경 재형성과 침습 과정의 핵심 요인에 대한 치료제 개발 및 약리학적 표적화로 확장됩니다. CO2 챔버에서 동물을 안락사시킨 후, 털을 70% ethanol로 적시고 건조시킵니다.마우스를 복와위로 고정한 다음, 뒷목부터 요추까지 머리-꼬리 방향으로 정중선 절개를 실시합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 양측의 피부 플랩을 들어 올려 피하 조직을 노출시킵니다. 두개경추 접합부가 확인될 때까지 마우스의 두개골을 촉진합니다.동물과 수직이 되도록 가위의 각도를 조절하여 두개경추 접합부의 경추 근육과 척추를 절단합니다. 그 다음, 척추를 꼬리 방향으로 박리하고 가위를 사용하여 제5요추 부위에서 완전한 미측 횡단 절제를 수행합니다. 이어서 마우스를 앙와위로 놓은 뒤, 목부터 복부까지 정중선을 따라 절개하고 피부를 외측으로 젖힌 후 복막을 절개하여 엽니다.두측으로 가위와 함께 흉벽을 절개합니다. 복막 및 후복막 장기를 제거한 후, 포셉과 수술용 메스를 사용하여 늑골을 절단하며, 이때 척추에서 약 5mm 정도의 늑골이 돌출되도록 남겨둡니다. 나머지 신체 부위에서 척추를 분리하여 제거합니다.그런 다음 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 4배율 배율의 실체 현미경 아래에서 비부착성 흡수 플랫폼 위에 척추를 동일한 두미 방향(craniocaudal orientation)으로 위를 향하게 배치합니다. 실체 현미경을 통해 관찰하면서 모든 척추 근육과 결합 조직을 제거합니다.신경이 척추에서 나오는 지점을 찾기 위해 갈비뼈를 지표로 사용하십시오. DRG는 경추, 흉추 및 요추에 위치합니다. 가위를 사용하여 척추체 중앙선을 절개해 척수를 볼 수 있는 창을 만들고, 척추체를 조심스럽게 젖혀 척수와 DRG 신경근을 노출시키십시오.다음으로, 스프링 가위를 사용하여 상부 늑골을 제거해 DRG를 노출시킵니다. DRG 외측에 있는 늑골을 따라 말초 신경을 내측으로 따라갑니다

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Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 신경 주위 침습을 연구하기 위해 병아리 융모축막(CAM)에서 등뿌리 신경절과 암세포를 공동 배양하는 방법을 설명합니다.

Chick Chorioallantoic Membrane 또는 CAM Tumor Model: An An An In Ovo Method to simulate Perineural Peripheral Imaging of Tumor Cells (병아리 융모대박막 또는 CAM 종양 모델: 종양 세포의 신경주위 침입을 시뮬레이션하기 위한 In Ovo 방법)

이 비디오에서는 마우스 등뿌리 신경절과 신경성 암세포를 공동 배양하여 체외 신경주위 암 세포 침입 모델을 개발하는 절차를 보여줍니다. 이 모델은 암 분석을 수행하여 빠르고 재현 가능한 결과를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

쥐 등뿌리 신경절과 암세포의 3차원 공동 배양 모델 구축: 신경주위 암세포 침입을 연구하기 위한 체외 모델

이 비디오에서는 신경 영양증과 신경 침습을 연구하기 위해 DRG와 암세포를 공동 배양하는 체외 방법을 보여줍니다.

체외에서 암성 신경 침입 모델링: 등뿌리 신경절과 암세포를 공동 배양하는 방법

이 비디오에서는 췌장암 세포를 좌골 신경에 주입하여 신경주위 침습을 위한 생체 내 마우스 모델을 개발합니다. 이 모델은 침입 정도를 정량화하고 암세포와 신경 간의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

쥐 신경주위 침입 모델: 마우스 좌골 신경에서 신경주위 침입을 시뮬레이션하기 위한 생체 내 모델 생성

이 비디오는 분리된 마우스 DRG 조직을 사용하여 등쪽 신경절 또는 DRG 외식 배양 및 DRG 해리 세포 모델을 개발하는 방법을 보여줍니다. 이러한 모델은 통제된 환경에서 뉴런-아교세포 상호 작용이 있는 다양한 메커니즘을 연구하는 데 도움이 됩니다.

등뿌리 신경절 이식 및 해리된 세포 배양 생성

신경주위 침습(PNI)은 두경부 편평세포암(HNSCC)의 흔한 특징으로, 생존율이 낮습니다. 그 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 반고체 기질에 국한된 쥐 등쪽 뿌리 신경절에서 생성된 신경돌기를 활용하여 HNSCC 세포주의 PNI와 관련된 경로를 조사할 수 있습니다.

머리와 목 편평 ​​세포 암에서 신경초 침략을위한 모델

좌 골 신경으로 syngeneic 췌장암 세포를 주입 하 여는 vivo에서 murine 모델 perineural 내 습의 설명 합니다. 모델 신경 내 습의 넓이의 부 량과 perineural 내 습의 세포 및 분자 메커니즘의 조사를 지원 합니다.

Vivo에서 Murine 좌 골 신경의 모델 Perineural 내 습

Perineural 침략은 머리와 목 편평 상피 세포 암 및 그밖 종양을 위한 공격적인 표현형입니다. 병아리 융모난성 막 모형은 혈관신생, 암 침략 및 전이를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 여기에서 우리는 이 모형이 생체내 perineural 침략을 평가하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보여줍니다.

두경부암의 신경성 침윤을 평가하는 생체내 병아리 융모난토암 막

이 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐에서 이식된 배근 신경절(DRG)을 수확하고 배양하는 기술을 제공합니다.

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

이 프로토콜은 마우스 등뿌리신경절(DRG)의 전체 마운트 및 해리 배양을 확립하는 방법과 종양-신경 상호 작용을 평가하는 데 사용하는 방법을 설명합니다.

배근 신경절 배양의 체외 모델 확립: 암-신경 누화 조사를 위한 보완적 접근 방식

배우세요 등쪽 뿌리 신경절과 암세포 공배양 모델을 이용한 신경 미세환경 재현 기법입니다. 이 방법은 췌관선암에서 암세포와 신경원 상호작용을 연구하고 표적 치료 개발에 활용됩니다.

등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서

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