단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

이 절차의 전반적인 목표는 단순 헤르페스 바이러스 감염 연구에 적합한 표피 시트를 준비하는 것입니다. 이것은 먼저 성체 꼬리 또는 신생아 등에서 거울 피부 샘플을 채취하여 수행됩니다. 다음으로, 표피는 dys 풀 2 처리에 의해 진피에서 분리됩니다, 그 후에 표피 장은 바이러스 현탁액에 뜹니다.

마지막으로, 감염된 표피 시트는 바이러스 감염을 감지하기 위한 면역 염색과 중간 필라멘트입니다. 궁극적으로 면역형광 현미경 검사는 기저층에서 감염된 세포의 수를 시각화하는 데 사용됩니다. 이 방법은 단순 포진 바이러스가 어떻게 표피 조직에 침입하여 수용체에 도달하여 감염을 시작하는지와 같은 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 박사후 연구원인 narran과 실험실의 대학원생인 Katarina 계층입니다. 희생 된 동물의 표피 시트 준비는 Landes, amp, VE 및 CHU North RH West Flia의 가이드의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행됩니다. 이 연구는 L-A-N-U-V 및 RW의 승인을 받아 10%FCS로 고포도당 및 글루타민 디펩타이드를 함유한 DMM을 10%FCS로 제조하고 페니실린 밀리리터당 100마이크로그램, 스트렙토마이신 밀리리터당 100마이크로그램을 준비하기 시작했습니다.

표피 시트를 준비하려면 가열 된 PBS에 밀리리터 당 5 밀리그램의 2 개의 분말을 조심스럽게 용해하십시오. 그런 다음 용액을 포인트 22 마이크로미터 필터에 통과시킵니다. 필터는 표피 구멍 마운트의 치료를 위해 직접 사용됩니다.

찬물, 생선 껍질에서 추출한 0.5% 분유 포인트 25% 젤라틴, 0.5% 트리톤 X 100으로 차단 버퍼를 준비합니다. 생후 1-3일 된 쥐의 몸통을 분리한 후 신생아 등 피부에서 표피를 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 구부러진 가는 집게를 사용하여 몸통을 제자리에 고정하고 뭉툭한 끝 가위를 두개골의 피부 아래로 움직여 등을 따라 코들 방향으로 움직여 피부와 몸통을 분리합니다.

그런 다음 메스로 등을 따라 피부를 자릅니다. 껍질을 약 10 x 10mm씩 1-2조각으로 자릅니다. 약 1ml의 PBS가 있는 6웰 플레이트의 한 웰로 조각을 옮기고 진피 면이 접시 바닥을 향하도록 합니다.

PBS를 제거하고 1.5ml의 디스크 기반 솔루션을 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후 PBS를 사용하여 조직 샘플을 세 번 세척합니다.

다음으로 겸자를 사용하여 진피를 잡고 두 번째 세트를 사용하여 표피를 온전한 시트로 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 기저면이 아래를 향하게 하여 표피 시트를 DMM으로 옮기고 즉시 조직을 감염 실험에 사용합니다. 또는 텍스트 프로토콜에 따라 1-3개월 된 쥐를 희생하고 꼬리를 자른 후 성인 꼬리 피부에서 표피를 준비하고, 메스를 사용하여 꼬리를 세로로 자르고, 뼈에서 피부를 벗겨낸 다음 메스를 사용하여 5 x 5mm 조각으로 자릅니다.

하나의 웰에 최대 4 개를 넣고 다이스를 진행하십시오. 방금 표피 세포를 해리시키는 것으로 입증된 두 번의 배양. 신생아 표피 시트를 6웰 플레이트에 넣고 기저 면이 재조합 트립신 기반 세포 해리 용액의 웰당 1.5밀리리터에 떠 있도록 합니다.

실온에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 DM EM 3ml를 첨가하여 소화를 멈추고 구부러진 미세한 집게를 사용하여 표피를 부드럽게 움직여 각질세포를 해리합니다. 6개의 웰 플레이트에서 세포 현탁액을 수집하고 웰에 1.5ml의 DMM을 추가로 추가합니다.

각질 세포를 배지로 수집하기 전에 조직 시트를 부드럽게 움직입니다. 다시 두 번 더 반복합니다. 또는 무효소 CDS의 표피 시트를 실온에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

두 번째 방 후 15분 동안 배양합니다. CDS를 부드럽게 피펫팅하여 각질 부위를 씻어냅니다. 세포 현탁액을 수집하고 새로운 DM EM을 사용하여 플러싱을 반복합니다.

HSV를 수행하기 위해 세 번 더 표피 시트의 한 가지 야생형 감염. 24웰 플레이트의 한 웰에서: 여기에 표시된 대로 표피 시트당 기저층에 있는 추정된 세포 수를 기반으로 바이러스 역가를 계산합니다. 500 마이크로 리터의 DM EM에 HSV 1 용액을 준비하십시오. 그런 다음 표피 시트에서 배지를 제거하고 DM EM에 HSV 셀당 약 100개의 플랫폼 유닛을 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 후 바이러스 배지를 DMM으로 교체합니다.

다양한 감염 후 표피 구멍 마운트를 준비하려면 3.4% 포름알데히드를 사용하여 상온에서 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 표피 시트를 고정합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 샘플을 두 번 세척한 후 차단 버퍼를 추가하고 해당 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 블로킹 버퍼를 1-60 희석된 마우스 anti ICP zero와 블로킹 버퍼에서 100 나노그램/100 나노그램의 토끼 polyclonal anti keratin 14로 교체하여 바이러스 유전자 발현과 중간 필라멘트 네트워크를 각각 시각화합니다.

다음 날 PBS 0.2%Tween 20으로 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 티슈를 실온에서 4시간 동안 4-5회 씻습니다. 그런 다음 여기에 나열된 대로 2차 항체를 추가하고 실온에서 밤새 배양합니다.

이전과 같이 실온에서 4시간 동안 세탁하십시오. 그런 다음 AAL 면이 시편 슬라이드를 향하도록 표피 시트를 장착합니다. 형광등 장착 매체를 추가하고 커버 슬립으로 덮습니다.

표피 cryo 단면도를 준비하기 위하여는, 활주를 2 번 세척하기 위하여 PBS를 사용한 후에 20 분 동안 실내 온도에 표피 장을 고치도록 4%formaldehyde를 이용하고, 조직 어는 매체에 있는 조정 장을 끼워넣고 액체 질소에서 얼기 위하여 이용하십시오. 그런 다음 극저온 마이크로톰으로 PBS에서 0.5% 포름알데히드로 8-10마이크로미터 절편을 절단합니다. 실온에서 10분 동안 섹션을 다시 고정합니다.

그런 다음 PBS를 사용하여 샘플을 두 번 세척하고 PBS에서 30분 동안 5% 일반 염소 혈청과 0.2% 트윈 20으로 차단합니다. 실온에서 마우스 anti ICP zero monoclonal antibody를 사용하여 조직을 60분 동안 염색한 후 차단 버퍼로 3회 세척합니다. 여기에 나열된 차단 버퍼에 2차 항체를 추가하고 실온에서 45분 동안 배양한 후 PBS로 3회 세척합니다.

마지막으로 형광등 장착 매체를 추가하고 커버 슬립으로 덮습니다. 이 방법의 과제는 진피에서 표피를 분리하기 위해 dispa 2 처리 후 HSV one이 기저층에서 침투 할 수있는 표피 시트를 준비하는 것입니다 중간 필라멘트 단백질 케라틴 14의 염색은 이상적으로 표피 기저 세포의 온전한 층을 드러내야하는 반면, C 57 black six 마우스의 표피 시트는 dys 공간의 1 밀리리터 당 5 밀리그램으로 처리하여 매끄럽게 분리되었습니다. 둘째, 동일한 절차로 B 6 A 2 G MX 1 마우스의 표피 기저층을 파괴하는데, 이는 케라틴 14 염색 세포가 거의 없기 때문입니다.

이 후자의 경우, 여기에 표시된 것처럼 온전한 기저층을 보존하기 위해 더 낮은 농도가 필요했습니다. 지금까지 hsv의 효율성에는 차이가 없습니다. 성인 마우스의 꼬리에서 채취한 표피 또는 갓 태어난 마우스의 등 사이에서 한 가지 감염이 관찰되었으며, 둘 다 바이러스 ICP zero HSV 하나의 감염이 콜레스테롤에 의존하는 약물 치료에 의해 보여지는 바와 같이 콜레스테롤에 의존하는 것과 같이 여포 간 표피의 효율적인 감염을 보여주며, nin one 결핍 표피는 nin one이 주요 수용체로 작용하는 반면 HVEM은 nin one이 주요 수용체로 작용함을 보여줍니다. 사소한 역할을 합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 단순 포진 바이러스가 조직으로 침입하는 것을 연구하기 위해 표피 시트의 생체 외 감염을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 도구는 생체 내 바이러스 감염의 초기 단계에서 역할을 하는 세포 결정 요인을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다.