2015년 10월 14일
우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 원발성 종양 특이적 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있는 방법을 보고합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 자기 기둥과 클로닝 링을 사용하여 종양 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 생쥐에서 절개된 종양 조직을 소화하여 단일 세포 현탁액을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 마그네틱 비드 컬럼을 사용하여 내피 세포 집단을 풍부하게 하는 것입니다.
다음으로, 내피 세포 집락을 성장시키고 클로닝 링 방법을 사용하여 선택합니다. 마지막 단계는 선택한 내피 세포 집락을 확장하고 특성화하는 것입니다. 궁극적으로, 특정 내피 세포 마커를 사용한 면역형광 현미경 검사는 클론 집단의 순도를 보여주는 데 사용됩니다.
사실 분류와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포에 더 부드럽게 작용하여 생존 가능한 내피 세포의 회복을 늘리고 후속 집락 확장을 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 종양의 혈관 내피 세포 기능 장애가 종양 진행에 어떻게 기여하는지와 같은 종양 혈관 신생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 내피 세포는 종양 미세환경의 다른 세포 유형으로 자주 오염되기 때문에 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 수 있으므로 안락사 후 배양에서 이러한 오염 세포를 신속하게 제거하는 데 부지런해야 합니다.
마우스를 깨끗한 벤치로 가져와 복부 쪽을 소독합니다.amp75%의 부피를 부피에 분무합니다. 에탄올 다음으로, 적절한 무균 기술을 사용하여 마우스의 팔다리를 해부 보드에 고정합니다. 복막을 열지 않고 복막을 그대로 유지하면서 정중선 복부 절개를 합니다.
피부와 복막 사이를 종양이 위치한 MA 땀샘 쪽으로 측면으로 절개합니다. 피부와 근육을 포함한 비종양 조직을 조심스럽게 다듬어 기억샘에서 종양 조직만 절제합니다. 절개된 종양을 30ml의 저포도당 D 에코, 변형된 독수리 배지 또는 LG DMEM이 들어 있는 원뿔형 튜브에 넣어 종양 해리를 시작합니다.
멸균 L-G-D-M-E-M의 조직을 조직 배양 접시로 옮기고 L-G-D-M-E-M으로 1-2회 세척합니다. 세척 후 L-G-D-M-E-M 2ml를 넣고 멸균 가위로 종양을 다집니다. 다진 종양에 콜라겐분해효소 5ml, 디스크 페이스 1ml, 데옥시 리보뉴클레아제 75마이크로리터, L-G-D-M-E-M 2ml를 추가합니다.
콜라겐분해효소 조직 혼합물을 페트리 접시에서 조직 해리 튜브로 옮깁니다. 미리 설정된 해리 프로그램을 사용하여 62번째 해리를 두 번 수행합니다. 섭씨 37도에서 75분 동안 가볍게 흔들면서 튜브를 배양합니다.
배양 후 50ml 원뿔형 튜브 위에 위치한 100미크론 세포 여과기를 통해 분해된 조직을 여과합니다. 필터를 5ml의 팩스 버퍼로 헹구어 남아 있는 세포를 모두 모으고 튜브를 280배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
다음으로, 10 x 스톡 1ml를 희석합니다. 적혈구 용해는 9ml의 멸균수에 완충액을 넣고 펠릿을 재현탁시켜 오염된 적혈구를 즉시 280배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 10ml의 팩스 버퍼에 세포를 다시 현탁시킵니다.
먼저 면역 자기 분리를 위해 혈구 분석기를 사용하여 살아있는 세포를 계수하고 100마이크로리터당 7개의 세포를 10개로 희석합니다. 팩스 버퍼에 100 마이크로 리터 당 10 마이크로 리터의 FCR 차단 용액을 추가하고 10 분 동안 얼음에서 배양합니다 차단 후 rat anti mouse PE conjugated CD 31 항체를 세포에 추가하고 10-15 분 동안 얼음에서 배양합니다. 가끔씩 교반하면서 10ml의 팩스 버퍼를 튜브에 넣고 280배 G로 5분 동안 원심분리합니다.
스내트를 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 5밀리리터의 팩스 버퍼 원심분리기로 세척한 다음 280배 G에서 다시 5분 동안 세포를 펠릿화한 다음 상등액을 흡인합니다. 이제 팩스 버퍼와 안티 PE 마이크로비즈를 세포에 추가하고 얼음 위에서 10-15분 동안 배양합니다. 가끔 교반하면서 10ml의 팩스를 넣고 버퍼를 뜯고 5분 동안 280배 G로 샘플을 원심분리합니다.
5ml의 팩스 버퍼 원심 분리기로 셀을 세척하고 부피를 300 마이크로 리터로 가져온 후 상층액을 제거합니다. 팩스 버퍼를 사용하여 35미크론 셀 스트레이너 캡이 있는 튜브를 통해 280배 G로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 자기 분리를 위해 상등액을 흡인합니다.
마그네틱 멀티 스탠드와 마그네틱 컬럼을 설정합니다. 세포 배양 후드에서 컬럼을 자기 분리기에 부착한 다음 컬럼을 2밀리리터의 팩스 버퍼와 동일시합니다. 다음으로, 반 밀리리터의 팩스 버퍼에 세포 구개를 다시 현탁시키고 평형 자기 기둥을 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다.
2ml의 팩스 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하는 동시에 15ml 원추형 튜브에 흐름을 수집합니다. 자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 플런저를 사용하여 2ml의 팩스 버퍼로 용리하여 컬럼에서 모든 셀이 제거되었는지 확인합니다. 새로운 15ml 원뿔형 튜브에 용출액을 수집합니다.
용출액 분획물을 280배 G에서 5분간 원심분리하고 상층액 윤활제를 제거합니다. 10ml의 내피 세포 배지에 세포를 동일하게 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 최소 4개의 10cm 젤라틴 코팅된 세포 배양 접시로 나누고 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 배양하여 다음날 약 1%의 예상 공동 유창성을 얻습니다.
내피 세포 집락은 7-10일 후에 형성되기 시작하고 7-10일 후에 집락이 나타나면 직경이 3-5mm로 자라야 하며 멸균 200마이크로리터 피펫 팁으로 비특이적 주변 세포를 제거합니다. 군체가 올바른 크기로 자랐으면 위상차 현미경을 사용하여 4배 또는 10배 배율로 접시를 보고 배양 접시 바닥에 개별 집락의 윤곽을 그립니다. 미세한 팁 마커를 사용하여 10ml의 PBS로 플레이트를 세척하고 소량의 PBS를 흡인하여 세포를 촉촉하게 유지합니다.
한 쌍의 해부 겸자를 사용하여 클로닝 링과 피펫을 집어 약 반 마이크로리터의 조직 접착제를 바닥에 넣습니다. 10마이크로리터 피펫 팁으로 클로닝 링 바닥에 티슈 접착제를 고르게 펴 바릅니다. 마크를 가이드로 사용하여 내피 세포 집락 위에 클로닝 링을 놓습니다.
복제 링을 부드럽게 눌러 링을 플레이트에 붙입니다. 다음으로, 25마이크로리터의 효소 세포 분리 용액을 클로닝 링에 피펫팅하고 약 1분 동안 또는 세포가 느슨하게 부착될 때까지 배양합니다. 각 클로닝 링의 세포를 6개의 웰 중 하나의 웰에 피펫팅합니다.
웰 플레이트. 50 마이크로리터의 내피 세포 배지로 링을 세척하여 남은 세포를 수집하고 6개의 웰 플레이트에서 동일한 웰로 옮기고, 세포를 새로운 접시로 옮기기 전에 80-100%co 유창성에 도달할 때까지 6개의 웰 플레이트에서 격리된 콜로니를 성장시킵니다. 면역 자기 내피 세포 분리만으로도 비내피 세포로 배양 오염이 발생하는 경우가 많습니다.
여기서 염료로 특이적으로 염색된 내피 세포인 I-A-C-L-D-L이 염색되지 않은 비내피 세포와 섞여 있는 것을 볼 수 있습니다. 콜로니에 클론 고리를 사용한 후, 확장된 세포 집단조차도 균일한 DI IAC LDL 염색을 보이며, 이는 개별적으로 분리된 3개의 콜로니를 비교하는 순수한 내피 세포 집단임을 나타냅니다. 뚜렷하고 균일한 CD 31 양성 집단이 분명합니다.
CD 31은 내피 세포 마커이고 IgG는 비특이적 항체 결합에 대한 동형 음성 대조군 역할을 합니다. 이 세포 집단은 또한 마우스 배아 섬유아세포 대조군보다 200배에서 7,000배 높은 내피 세포 마커 유전자의 발현이 증가한 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 분리된 정상 또는 종양 내피 세포는 배양에서 자발적인 혈관 다리 구조 형성에 의해 입증된 바와 같이 내피 세포 기능을 유지합니다.
이 동영상을 시청한 후에는 집락 선택 및 체외 증식과 함께 면역 자기 농축을 사용하여 종양 특이적 내피 세포를 충실도로 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 유전자 조작된 마우스 모델에서 1차 종양 특이적 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 이 절차는 내피 세포 군집의 순도와 생존율을 보장하기 위해 여러 단계를 포함합니다.
Isolating pure tumor-specific endothelial cells enables mechanistic interrogation of tumor angiogenesis pathways and supports preclinical evaluation of anti-angiogenic therapeutics. This method addresses a critical bottleneck in target validation by providing contaminant-free endothelial cultures that retain phenotypic stability, thereby improving predictive confidence in early discovery decisions. The approach facilitates reproducible generation of disease-relevant cellular models for lead identification and biomarker alignment in oncology pipelines.
The method integrates into the oncology discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a renewable source of tumor-specific endothelial cells for mechanistic and phenotypic assays.