PCR에 의한 날 (30) 돼지 배아의 정확하고 페놀 무료 DNA Sexing

이 절차의 전반적인 목표는 각 배아에서 얻은 페놀 프리 DNA를 사용하여 30일째 돼지 배아의 성별을 정확하게 식별하는 것입니다. 그리고 PCR 반응을 위한 두 쌍의 성 특이적 프라이머. 이 방법은 다양한 부계 요인뿐만 아니라 자궁 용능 및 모돈의 대사 상태를 포함한 성비에 대한 모계 요인의 영향과 같은 가축의 생식 생리학과 관련된 다양한 질문에 답할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

이 기술의 장점은 DNA 정제 중에 페놀-클로로포름과 같은 독성 화학 물질이나 값비싼 컬럼이 없다는 것입니다. 자, 이제 도로에서 공연을 시작해 볼까요? 이 방법을 시각적으로 보여주는 것은 증상 준비만큼이나 중요합니다.

단계는 배우기 쉽지만 증상 교차 오염을 방지하기 위해 세부 사항에 대한 특별한 주의가 중요합니다. 텍스트에 따르면 배아 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고로 옮깁니다. 분석할 샘플 수에 필요한 샘플 ID로 샘플 튜브에 레이블을 지정합니다.

드라이아이스를 사용하여 열 용기를 반쯤 채우고 미리 라벨링된 샘플 튜브를 드라이 아이스에 삽입합니다. 겨울 장갑을 착용하고 검사 장갑 한 켤레를 맨 위에 놓고 미리 냉각된 절구와 절굿공이를 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 드라이아이스 용기로 옮깁니다. 다음으로, 드라이 아이스의 절구 안에 냉동 배아를 넣은 다음 배아를 덮을 수 있도록 충분한 액체 질소를 붓습니다.

그리고 유봉을 사용하여 고운 가루로 갈아냅니다. 마이크로주걱을 사용하여 배아 분말을 미리 라벨이 부착된 샘플 튜브에 옮기고 튜브를 음의 80도 냉동고에 넣습니다. 각 추가 배아의 분쇄 및 동결을 반복하고 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 검사 장갑을 교체합니다.

분석할 샘플 수에 필요한 모든 미세 원심분리 튜브에 라벨을 붙인 후, 배아 분말이 들어 있는 샘플 튜브를 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 드라이아이스 용기로 옮깁니다. 180 마이크로리터의 50 밀리몰 수산화나트륨을 미리 라벨이 부착된 각 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 인큐베이터를 섭씨 95도로 예열합니다.

이쑤시개를 사용하여 약 5-10mg의 배아 분말을 샘플 튜브에서 사전 라벨링된 수산화나트륨 튜브로 옮깁니다. 용액에서 이쑤시개를 천천히 들어 올려 DNA 용해물을 끈적끈적한 흰색의 투명한 물질로 시각화합니다. DNA 용해물이 포함된 샘플을 섭씨 95도의 인큐베이터로 5분 동안 옮긴 다음 즉시 튜브를 얼음으로 채워진 절연 용기로 옮깁니다.

다음으로, 20마이크로리터의 1몰 트리스-하이드로클로라이드를 튜브에 직접 넣고 튜브를 두드려 부드럽게 섞습니다. pH 종이를 사용하여 pH가 약 8.0인지 확인합니다. 그런 다음 튜브를 2,000G에서 원심분리하고 2분 동안 실온을 유지하여 용해되지 않은 조직 파편을 제거합니다.

150마이크로리터의 상단 투명 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 또는 96웰 플레이트. 그리고 최대 2주 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오.

또는 최대 1년 동안 섭씨 영하 20도. 이 프로토콜의 성공 여부는 X 염색체와 Y 염색체에 프라이머를 얼마나 구체적으로 설계하느냐에 달려 있습니다. 그렇다면 X염색체와 Y염색체에 있는지 어떻게 확인할 수 있을까요?

NCBI Map Viewer를 사용하는 것이 이를 표시하는 가장 좋은 방법입니다. PCR을 위한 성별 특이적 프라이머를 설계하려면 NCBI 웹사이트를 사용하여 모공 징후 성별 결정 영역 Y.Or SRY 및 아연 손가락 단백질 X-염색체 연관 또는 ZFX에 대한 등록 번호를 얻습니다. 식별 번호를 복사하여 온라인 프라이머 디자인 도구에 붙여넣습니다.

뉴클레오티드 블라스트 또는 블라스트 N을 사용하여 현재 공극 징후 게놈 데이터베이스 104에 대한 프라이머의 특이성을 검증합니다. 염기서열을 입력하려면 각각 SRY 및 ZFX의 X 및 Y 염색체에만 위치합니다. DNA 용해물로 PCR을 수행하려면 핫스타트 레디 믹스 PCR 효소를 사용하고 15마이크로리터 PCR 반응에서 최종 농도 0.3마이크로몰에서 2개의 성 특이적 프라이머를 추가하여 마스터 믹스를 준비합니다.

처음으로 반응을 실행하는 경우, 1마이크로리터의 상업적으로 얻어진 성 공극 징후 게놈 DNA를 추가하여 무템플릿 음성 대조군을 위한 1개의 PCR 튜브와 양성 대조군을 위한 2개의 추가 튜브를 준비합니다. 후속 PCR 라운드의 경우, 마지막으로 성공한 성별 분석의 샘플 1마이크로리터를 양성 대조군으로 포함합니다. 써모사이클러에 다음 PCR 프로그램을 설정하고 PCR을 수행합니다.

PCR 후 샘플을 varify하려면 사이버 DNA 젤 염색 또는 브롬화 에티듐이 있는 2%TBE 아가로스 겔을 준비합니다. 1.5마이크로리터의 10X 로딩 염료를 샘플에 첨가한 후 겔에 로딩하고 실행합니다. 형광등 아래에서 밴드 강도를 관찰 및 조정하고 젤의 이미지를 캡처합니다.

배아를 한 밴드는 여성으로, 두 밴드는 남성으로 식별합니다. 여기에 표시된 것은 PCR로 스크리닝된 345개의 DNA 용해물에서 성별 결정에 대한 대표적인 결과입니다. 최적의 프라이머의 어닐링 온도인 섭씨 65도는 유사한 강도 및 예측된 암필콘 크기를 생성하기 위해 여기에 표시된 프라이머의 TM보다 눈에 띄게 높습니다.

SRY 및 ZFX의 두 가지 증폭 제품이 여기에 나와 있습니다. 여성 배아의 용해물 샘플은 X 염색체에 위치한 ZFX 유전자의 506 기반 쌍 DNA 단편으로 구성된 단일 밴드만 생성합니다. 모든 남성 배아는 SRY의 경우 400 염기쌍, ZFX의 경우 506 염기쌍의 동일한 강도로 두 개의 DNA 단편을 생성합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, DNA 용해물은 345개의 배아를 스크리닝한 후 어떠한 PCR 반응 억제도 나타내지 않았다. 단지 3명만이 성교를 하지 않았고 여성 배아의 비율은 남성보다 약간 높았다. 분쇄에서 PCR 수행까지 이 기술을 마스터하면 약 10개의 배아를 처리하는 데 약 1시간이 걸립니다.

이 기술을 수행할 때, 특히 배아 분말을 튜브로 옮길 때 교차 오염을 피하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 DNA 메틸화, 마이크로어레이 및 염기서열분석과 같은 다른 방법을 사용하여 성별 간 영양 및 전염병의 게놈 및 후성유전학적 영향을 조사할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 생식 생리학 및 동물 과학 분야의 연구자들이 다양한 가축 종의 성적 이형성과 관련된 연구를 수행할 수 있는 길을 열 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 성별 특이적 프라이머를 설계하고, 배아에서 DNA를 추출하고, DNA 용해물을 사용하여 PCR 반응을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 드라이아이스로 작업하는 것은 매우 위험하므로 적절한 예방 조치를 취하고 장갑과 고글을 착용하십시오.