March 18th, 2016
여기에서는 외성장 배양 분석으로 일차 마우스 심외막 세포를 분리하고 생체 외 심장 배양 시스템을 사용하여 표피 유래 세포(EPDC)의 기능적 이동을 평가하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 EMT(epicardial epithelial-to-mesenchymal transition) 및 운동성의 유전적 및 화학적 조절자를 식별하는 데 적합합니다.
외성장 배양 방법 및 생체 외 이동 분석법의 전반적인 목표는 상피에서 중간엽으로의 전이를 연구하기 위해 표막 세포의 1차 배양을 분리하고 각각 표막 유래 세포의 기능적 이동을 평가하는 것입니다. 이러한 기술의 주요 장점은 심외막에서 1차 배양을 분리하고 심외막 유래 전구 세포의 내재적 거동을 쉽게 테스트할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 심장 재생 의학에서 외막 유래 세포 생물학을 조작하기 위한 전략 개발로 확장됩니다.
심외막 세포 분리를 준비하기 위해 예열 콜라겐 코팅된 챔버를 실온으로 밀어 넣고 웰당 100마이크로리터의 중간 A를 추가합니다. 챔버를 코팅한 후 매체를 제거하여 고인 매체가 남아 있지 않도록 합니다. 1차 심외막 세포를 분리하기 위해 먼저 성교 후 11.5일에 마우스 배아를 채취합니다.
집게를 사용하여 배아의 흉벽을 꼬집고 정중선에서 조직을 찢어 흉강을 노출시킵니다. 다음으로 겸자를 심장 뒤에 놓고 유출로를 잡습니다. 배아에서 심장을 빼내고 심장 조직을 등쪽이 아래를 향하게 하여 콜라겐으로 코팅된 슬라이드의 단일 웰에 넣습니다.
모든 심장이 개별 웰에 배치되면 조직이 콜라겐 매트릭스에 부착될 수 있도록 섭씨 37도에서 5%CO2에서 챔버 슬라이드를 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 각 심장 주위에 20-50마이크로리터의 예열된 이식 배지 A를 조심스럽게 추가하고 슬라이드를 약 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣어 심외막 성장을 촉진합니다. 너무 많으면 조직이 분리될 수 있고 너무 적은 배지는 탈수를 일으켜 파생물의 품질을 떨어뜨릴 수 있으므로 외식식물에 적절한 양의 배지를 추가하는 것이 중요합니다.
배양 후 3-4시간 이내에 성장이 관찰될 수 있으며 24시간까지는 주로 중간엽 세포 오염이 최소화된 조약돌 형태를 나타내는 중피 세포로 구성됩니다. 중간엽 세포의 침입이 심외막 세포 성장을 오염시키기 전에 심장을 제거하는 데 주의를 기울여야 합니다. 다음 날, 집게를 사용하여 심외막이 고갈된 심장을 1점 5밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
그런 다음 800마이크로리터의 트리졸을 추가하고 나중에 다운스트림 분석을 위해 샘플을 섭씨 영하 80도로 보관합니다. 그런 다음 DPBS로 각 웰을 세척하여 혈액 세포와 과도한 세포 파편을 제거합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 Cre 재조합효소를 발현하는 아데노바이러스가 보충된 500마이크로리터의 외식 배지 B로 24시간 동안 배양합니다.
후속 세포 이동을 추적하기 위한 심외막 라벨링의 경우, 방금 시연한 바와 같이 12.5일 째 성교 후 임신 댐에서 배아 심장을 분리하고 사전 예열된 생체 외 배양 배지를 포함하는 24웰 플레이트의 개별 웰에 배치합니다. 섭씨 37도, CO2 5%에서 부드러운 흔들림으로 심장을 배양합니다. 심장이 잠복하는 동안 아데노바이러스 GFP의 밀리리터당 6번째 PFU와 섭씨 37도의 생체 외 배양 배지 12밀리리터에 3점 오를 10배로 재현탁합니다.
그런 다음 6ml의 바이러스 공급 배양 배지를 새로운 15ml 튜브로 옮기고 아데노바이러스 Cre를 1점의 5배에 10을 곱한 최종 농도에 1ml당 6번째 pfu를 추가합니다. P1000 피펫을 사용하여 각 심장에서 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 각 웰에 아데노바이러스 GFP 아데노바이러스 Cre 용액을 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 다시 24시간 동안 부드럽게 흔들어 넣습니다.
다음날 상피에서 중간엽 유도로의 경우 P1000 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 제거합니다. DPBS 1ml로 심장을 조심스럽게 헹굽니다. 그런 다음 세척을 버리고 TGF 베타 원과 혈소판 유래 성장 인자 BB를 함유한 갓 준비된 생체 외 배양 배지로 심장을 보충하고 세포 배양 인큐베이터에서 부드러운 흔들림으로 24시간 동안 배양합니다.
외막 세포 외식은 심외막 및 중피 마커의 강력한 발현을 나타내며 심외막이 고갈된 심장에 비해 심근세포 유전자의 발현이 낮습니다. 이들의 정체를 추가로 확인하기 위해 심장 제거 후 48시간 후에 심외막 세포 배양을 고정하고 Wilms'tumor 1 및 ZO-1에 대한 항체와 함께 염색하여 각각 중피 세포와 세포 간 밀착 연접을 라벨링합니다. 24시간의 자극 후 심외막 세포는 특히 배양 주변부에서 ZO-1 염색이 감소하고 평활근 알파-액틴 양의 스트레스 섬유가 견고하게 새로운 형태로 형성되는 중간엽 표현형을 채택합니다.
대조적으로, 단층 중심에서 더 정의된 세포 간 접촉이 있는 합류 심외막 세포는 피질 영역과 관련된 평활근 알파-액틴을 나타냅니다. 플럭스 대립유전자의 Cre 매개 절제에 의한 miocardin 관련 전사 인자 신호 축 유전자의 결실은 심외막 유래 세포의 심하 공간으로의 이동을 약화시킵니다. 반대로, myocardin 관련 전사 인자 A의 강제 발현은 심외막 유래 세포에 의한 콜라겐 IV 기저막의 증가된 이동 및 파괴를 초래합니다.
일단 숙달되면 각 기술은 적절하게 수행되면 48시간에서 72시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 조직 이식에서 심외막 세포 성장을 최적화하고 심외막 유래 세포 이동 전에 심외막에 라벨을 붙이기 위해 적절한 발달 단계에서 배아를 분리하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자 조작 또는 화학적 변형과 같은 다른 방법을 수행하여 심외막 유래 세포 동원 및 분화의 새로운 조절자를 식별하는 것에 대한 질문에 답할 수 있습니다.
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이 기사는 외생 배양 시험을 사용하여 1차 마우스 심장 외막 세포를 분리하고, 심장 외막 유래 세포(EPDC)의 기능적 이동을 ex vivo 심장 배양 시스템을 통해 평가하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 심장 외막 상피-간질 전환(EMT)과 이동성의 유전자 및 화학적 조절자를 식별하기 위해 설계되었습니다.
Epicardial outgrowth culture and ex vivo migration assays provide a robust platform for dissecting the mechanisms of epicardial-derived cell (EPDC) mobilization, migration, and differentiation. These methods enable functional interrogation of genetic and chemical modulators relevant to cardiac repair, supporting predictive confidence in early discovery and target validation for regenerative medicine portfolios. Their integration into discovery pipelines advances mechanistic de-risking and informs risk-adjusted progression of cardiac regenerative strategies.
These assays position within the early discovery to preclinical continuum, enabling functional hypothesis testing, target validation, and mechanistic de-risking for cardiac regenerative programs.