의 헤어 난포 피침 엔딩에서 생활 신경 터미널 라벨의 광학 모니터링 전의 VIVO 마우스 귀 피부

이 새로운 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 완전히 분화된 기계감각 신경 말단의 기능을 조사하기 위해 쥐 귀에 있는 모낭의 접근성을 입증하는 것입니다. 이 방법은 기계적 감각에서 시냅스와 같은 소포의 역할과 같은 기계감각 신경과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점은 빠르고, 완전히 분화된 무수한 살아있는 기계감각 신경 말단에 쉽게 광학적으로 접근할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 사람들은 모낭을 손상시키지 않고 피부를 분리하고 연골을 적절하게 청소하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 기본 기술을 보여주는 것 외에도 여기에서는 신경 말단 기능의 중요한 부분의 칼슘 의존성을 살펴보는 실험의 예도 보여줍니다. 50mm 실리콘 안감 접시에 Liley의 용액 또는 기타 생리적 식염수를 채웁니다.

15분마다 용액을 새로 고치거나 지속적인 관류를 사용합니다. 젊은 성인 쥐의 목을 베고 가위를 사용하여 빽빽한 헤어 라인 바로 위의 기부 근처의 외부 귀를 제거하고 접시에 귓바퀴를 옮깁니다. 이제 미세한 곤충 핀을 사용하여 여백을 따라 오목한 면이 아래로 향하게 하여 귀를 고정합니다.

그런 다음 둔기 해부를 사용하여 노출된 뒤쪽 피부를 조심스럽게 벗겨냅니다. 3번 집게를 사용하여 중앙 뒤쪽 피부를 잡고 다른 집게로 피부와 귀 기저부의 연골 사이의 틈을 뚫습니다. 틈새 내에서 겸자를 좌우로 부드럽게 움직여 전방 및 후방 피부층을 점차적으로 분리합니다.

중앙 연골을 가로질러 얇은 연골이 없는 가장자리로 체계적으로 이동합니다. 이것은 연습이 필요할 것입니다. 뒤쪽 피부를 제거한 후 앞쪽 피부 옆에 진피면이 위로 향하게 하여 고정합니다.

두 피부 제제에서 연골을 제거한 후 모낭 기저를 덮고 있는 거품이 많은 섬유탄성 연골층을 제거합니다. 이 조직을 부드럽게 껍질을 벗기고 뽑고 문지릅니다. 이것은 또한 마스터하기 위해 연습이 필요합니다.

너무 적게 제거하면 염료와 염료의 시각화를 방해하고 너무 많이 제거하면 신경 말단이 손상됩니다. 어린 마우스를 사용하면 전방 피부층과 후방 피부층 사이의 유착과 아래 연골을 제거하는 어려움을 최소화할 수 있습니다. 이 두 가지 모두 성공적인 염색을 볼 가능성을 높입니다.

각 피부 제제는 리플리컨트의 수를 최대화하고 사용되는 동물을 최소화하기 위해 정점에서 기저부까지 반으로 절단할 수 있습니다. 이 섹션에서는 FM1-43으로 조직을 염색하는 방법을 설명하지만, 농도를 적절하게 조정하면 이 등급의 대부분의 다른 스티릴 피리디늄 염료와 함께 작동해야 합니다. 최소한의 주변광 수준에서 이 절차를 수행합니다.

시작하기 전에 적절한 가스가 주입된 생리적 식염수에 10마이크로몰 FM1-43을 제제당 3ml로 충분히 만듭니다. 각 준비물을 실리콘을 깐 별도의 35mm 접시에 적절한 식염수 2ml와 함께 넣습니다. 염료 흡수를 유지하는 칼슘과 바륨의 능력을 비교하려면 이 시점부터 별도의 접시에서 배양하십시오.

일부는 일반 Liley's 2 millimolar 칼슘에 넣고 다른 일부는 바륨이 칼슘을 대체하는 Liley's에 넣으십시오. 다음으로, 섭씨 30도의 수조에서 약간 잠긴 플랫폼에 열린 접시 준비를 놓습니다. 수심은 접시에 쏟아지지 않고 조직을 데울 수 있을 만큼 충분해야 합니다.

각 접시에 실리콘 베이스에 미세한 가스 라인을 고정하여 초당 약 10개의 거품으로 준비물을 가스화합니다. 또한 단단히 마개를 가진 병에 FM1-43 용액과 100ml의 무염료 식염수를 예열합니다. 모든 것이 섭씨 30도로 평형을 이루도록 하고 30분 후에 적절한 데운 용액을 사용하여 조직의 무염료 식염수를 교체합니다.

30분 더 배양합니다. 배양 후 염료가 없는 식염수를 붓고 제제 주변에 남아 있는 액체를 빠르고 조심스럽게 닦아냅니다. 노출된 피부 표면을 만지지 않도록 주의하십시오.

준비물을 수조에 다시 넣고 가스 주입 라인을 전체적으로 제자리에 유지하십시오. 이제 2-3 밀리리터의 칼슘 또는 바륨 함유 따뜻한 염료 용액을 첨가하십시오. 40분 후, 남은 절차 동안 조직을 실온으로 되돌려 내재화된 염료의 재방출을 억제합니다.

이제, 3 단계로 내재화되지 않은 염료를 제거하십시오 : 첫째, 라벨링 용액을 붓고 실온의 식염수로 조직을 빠르게 연속적으로 세 번 헹군 다음 30 분 동안 배양하여 표면 막에서 나머지 염료의 대부분을 분해합니다. 마지막으로, 칼슘 또는 바륨 식염수로 적절하게 구성된 술폰화 b-사이클로덱스트린 유도체로 제제를 킬레이트화하여 노출된 멤브레인의 외부 소엽에 부착된 잔류 염료를 제거합니다. 따라서 남아 있는 모든 염료는 조직 내에 있게 됩니다.

킬레이트 처리 후 제제를 적절한 신선한 염료가 없는 식염수에 다시 넣고 티슈 페이퍼로 접시 외부를 철저히 말리십시오. 그런 다음 가능한 한 빨리 이미지를 만드십시오. 최소한의 주변 조명에서 계속 작동하십시오.

이미징하기 전에 실체 현미경을 사용하여 자동 형광을 일으키고 이미지를 오염시킬 수 있는 표면 파편을 제거합니다. 그런 다음 표준 플루오레세인 필터 세트가 있는 직립 상피 형광 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 다음으로, 신경 말단을 편안하게 찾을 수 있을 만큼만 제제가 비춰질 때까지 중성 밀도 필터를 사용하여 여기광 강도를 감쇠합니다.

전체 조명은 신경 말단을 다소 빨리 죽일 것입니다. 일단 위치를 찾으면 10x 건식 대물렌즈 또는 20x 침수 대물렌즈를 사용하여 라벨링된 피침형 말단의 이미지를 캡처합니다. 1/2에서 1초의 카메라 통합 시간을 사용하여 광도 및 노출 시간을 최소화합니다.

각 제제에 대해 귓바퀴 피부 기저부의 절단 가장자리에서 가장 먼 가장자리에서 시작하여 이 가장자리를 따라 작업하면서 각 여포를 차례로 이미징하여 약 20개의 피침형 말단을 이미지화합니다. 절단된 가장자리와 평행하게 약간 겹치는 필드에서 동일한 난포를 두 번 이미징하거나 명백하게 손상된 모낭을 이미징하지 않고 작업합니다. 가장자리 스트립을 완성한 후 귓바퀴 밑부분을 향해 한 필드 너비로 이동하고 반대 방향으로 이 과정을 반복합니다.

분석은 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 칼슘 함유 식염수로 표시된 난포를 보여주는 첫 번째 접시를 이미징한 후, 바륨 함유 식염수로 난포를 이미지화합니다. 이런 식으로 계속하십시오.

나머지 대조군 및 실험 조직의 이미징이 시간이 일치하는지 확인하고, 라벨링 후 염료는 구성적 SLV 재활용의 exocytosis arm에 의해 다시 방출됩니다. 일반적인 귓바퀴 제제에서 모낭은 형광 없이 투과 조명 아래에서 쉽게 볼 수 있으며, 이는 제제의 웨이퍼처럼 얇은 특성과 이러한 기계 감각 말단에 대한 상대적인 접근성 용이성을 보여줍니다. 상형광(epifluorescence) 하에서는 각 모낭을 둘러싸고 있는 표지된 피침형 말단이 명확하게 보이며 일반적으로 강력한 자발적 FM1-43 흡수를 보여줍니다.

반점 패턴은 말단의 길이를 따라 피부에 직교하는 광학 평면에서 관찰되는 말단을 반영합니다. 이 방법의 많은 응용 분야 중 하나는 엑소사이토시스 역학(exocytosis kinetics) 연구에 있습니다. 예상대로, 염료 흡수가 소포 재활용으로 인한 것이라면 상단 패널에서 표지된 단자가 자발적으로 염색되는 것을 볼 수 있습니다.

강력한 엑소사이토시스 자극제인 알파-라트로톡신(alpha-latrotoxin)을 적용한 후, 하단 두 패널에서 볼 수 있듯이 자연적인 탈색 과정이 가속화됩니다. 비디오에서 볼 수 있듯이 또 다른 응용 분야는 세포내이입의 칼슘 의존성을 조사하는 것입니다. 칼슘과 바륨을 함유한 식염수 모두에서 피침형 말단에 대한 뚜렷한 염료 흡수가 관찰되었습니다.

비디오에서 라벨링된 것으로 보이는 말단의 형광 강도를 정량화한 결과, 염료 흡수율에는 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. 이는 세포내이입이 바륨과 칼슘에 의해 동등하게 잘 지원된다는 것을 나타냅니다. 다른 귀 준비물에 대한 절차를 더 반복하면 이 결론을 테스트할 수 있습니다.

일단 마스터하면 이 전체 프로토콜과 이미징을 2시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 작은 마우스를 사용하고, 빠르게 해부하고, 필요한 빛의 강도를 최소화하기 위해 최대한 어둡게 적응하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 우리는 가까운 동료이자 지금은 은퇴한 교수인 Clarke Slater와 그의 석사 학생 Michael Caine이 처음 개발한 방법에서 이 방법에 대한 아이디어를 적용했습니다.

근육 방추의 기계감각에서 시냅스와 같은 소포가 할 수 있는 역할에 대해 말했을 때, FM1-43보다 더 나은 시각화 방법이 필요하다고 말했습니다. 이 절차는 약리학 및 전기 생리학과 같은 다른 방법과 함께 사용할 수도 있습니다. 그런 다음 시냅스와 같은 소포 재활용이 어떻게 조절되는지, 그리고 이것이 기계 감각 종말의 반응성과 어떤 관련이 있는지 연구할 수 있습니다.