안구 약의 약동학 연구에서 토끼 눈의 사용

이 실험의 전반적인 목표는 토끼 눈을 사용하여 안구 내 약물의 약동학적 특성을 조사하는 것입니다. 이 방법은 유리체강내 주사 약물의 약동학과 같은 안구 약리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 토끼 안구가 상대적으로 커서 유리체강내 주사 기술과 주사된 약물의 안구 내 분포가 인간과 비슷할 수 있다는 것입니다.

또한 토끼는 영장류보다 다루기 쉽고 저렴합니다. 이 기술의 의미는 안구 내 약물 전달에 대한 것인데, 약물 전달의 사용은 안구 구획의 약물 농도와 작용 기간에 큰 영향을 미치기 때문입니다. 따라서 시간 경과에 따른 약물 농도를 각 격실에서 조사해야 합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 홍혜경(Hye Kyoung Hong)입니다. 건강한 뉴질랜드 흰 토끼를 마취한 후 텍스트 프로토콜에 따라 국소 마취 안약을 바르고 각막에 습윤 연고나 젤을 바르면 마취에서 회복될 때까지 안구 건조를 방지할 수 있습니다. 동공을 확장시키려면 페닐에프린 염산염 한두 방울과 트라피카마이드를 바르십시오.

면봉을 사용하여 10% 포비돈 요오드를 안구 주위 피부에 바릅니다. 그런 다음 5% 포비돈 요오드 한 방울을 눈의 결막에 떨어뜨립니다. 다음으로, 주사기에 부착된 30게이지 바늘을 사용하여 관심 약물을 공막 표면에 수직으로 상측두측두의 수술 림버스 뒤 1mm 떨어진 유리체 내로 주입합니다.

공막의 누출을 최소화하는 것이 중요한데, 누출은 편향의 원인이 될 수 있기 때문입니다. 유리강에서 누출을 방지하기 위해 바늘 제거 후 면봉을 바르고 최소 30초 동안 압박을 가해야 합니다. 상처 치유를 위한 충분한 시간을 가진 후, 일주일 동안 매일 치료한 토끼를 관찰하고, 그 후 일주일에 한 번 심각한 안구 내 염증의 징후가 있는지 관찰합니다.

문자 프로토콜에 따라 토끼를 안락사시킨 후 눈꺼풀 견인기를 사용하여 안검 열구를 엽니다. 윤부에서 2-3mm 후방에서 360도 결막 절개를 만들고 결막과 장부 낭을 지구에서 절개하여 후방으로 확장합니다. 안구 외 근육을 지구본에 삽입하는 것에 가깝게 자릅니다.

그런 다음 구부러진 집게로 시신경을 고정하고 집게와 구체 사이의 신경을 자릅니다. 주변 조직은 그대로 두고 안구 자체를 제거합니다. 그런 다음 액체 질소를 사용하여 즉시 안구를 동결하고 섭씨 80도에서 보관하십시오.

안구를 분리하고 모든 시점 동안 동결한 후 해동하기 전에 얼어붙은 안구를 세 개의 구획으로 빠르게 분리하십시오. 유리체액(vitreous), 수액(aqueous humor), 망막(retina choroid). 얼어붙은 안구를 세 개의 구획으로 분리하는 것은 안구가 해동되면 쉬운 일이 아닙니다.

조직을 얼린 상태로 유지하면서 세 개의 구획을 빠르게 분리하는 것이 파티션 성공의 핵심 단계입니다. 다음으로, 지구본을 열려면 메스 날을 사용하여 각막 가장자리를 절개하고 전방 분절과 후방 분절을 절개하여 분리한 다음 홍채 앞의 동결된 구획인 수액을 분리합니다. 조직 집게로 얼어붙은 홍채와 수정체를 당겨 제거함으로써 조직을 제거합니다.

그런 다음 유리체에 접근할 수 있게 되면 나머지 망막, 맥락막 및 공막과 분리합니다. 이제 15번 메스 날을 사용하여 밑에 있는 공막에서 망막 맥락막 조직을 분리합니다. 면역 분석의 경우, 수액 샘플을 해동하고 각 샘플의 부피를 측정합니다.

냉동 샘플이 들어있는 튜브의 무게에서 빈 튜브의 무게를 빼서 냉동 샘플의 무게를 계산합니다. 유리체 샘플을 칭량한 후 BSA가 1%인 PBS를 사용하여 조직을 해동하고 용해시킵니다. 그런 다음 섭씨 4도의 회전기에 하룻밤 동안 놓습니다.

그런 다음 조직을 387배 G로 10분 동안 원심분리합니다. 냉동 조직을 칭량한 후 레티노맥락막 샘플을 균질화하려면 단백질 추출 시약을 1:10의 조직 대 시약으로 첨가합니다. 그런 다음 미리 냉각된 조직 마이크로균질화기를 사용하여 조직을 균질화합니다.

12, 000에서 20, 000 번 G로 10 분 동안 용해 된 샘플을 원심 분리하고 상등액을 식힌 EPP 튜브로 옮깁니다. ELISA를 수행하려면 하나의 XPBS에서 0.1% BSA를 사용하여 유리체, 수액 및 망막맥락막 샘플을 검출 한계 내의 농도로 희석하고 이에 대해 분석에 사용합니다. 샘플의 웰당 100마이크로리터를 분취하고 96웰 플레이트에 관심 약물의 알려진 농도를 분취하여 표준 곡선을 구성합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 밤새 접시를 배양한 후 200마이크로리터의 세척액을 사용하여 접시를 세 번 세척합니다. 0.1% BSA를 가진 PBS에서 2차 항체 1개에서 20, 000를 묽게 하고, 분석실험 판의 각 well에 100 마이크로리터를 추가하십시오. 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 배양한 후 OD 450을 측정합니다.

표준 곡선을 생성하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플의 약물 농도를 계산한 후 Phoenix Winnonlin 소프트웨어와 같은 모델링 소프트웨어를 사용하여 구획 모델로 약물 농도 데이터를 분석합니다. WNL5 클래식 모델링에서 PK 모델을 클릭하고 설정 메뉴에서 관찰 시간, 투여 용량 및 약물 농도를 매핑합니다. 최종 격실 모델을 선택하고 텍스트 프로토콜에 따라 관심 있는 pharmecokinetic 매개변수를 계산합니다.

관심 약물의 유리체강내 주사 및 조직 샘플의 준비 후 이 비디오에서 입증된 바와 같이 ELISA를 수행하여 유리체, 수액 및 망막체의 약물 농도를 측정했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 색상의 광학 밀도는 관심 약물의 농도와 관련이 있습니다. 표준 곡선에서 계산된 농도 데이터는 약동학 모델에 적합할 수 있으며, 약동학 매개변수는 적합선에서 결정할 수 있습니다.

본 실험에서는 여러 시점에 걸쳐 유리체강을 주입한 베바시주맙(Bevacizumab)과 유리체절제술을 받지 않은 안구에 대한 유리체강내 동역학(pharmecokinetics)을 평가하고 비교하였다. 여기에서 볼 수 있듯이 피팅된 모델에 따른 추정 농도는 실제 측정값과 상당히 잘 일치했습니다. 베바시주맙의 유리체 농도 또는 반감기에는 유의한 차이가 없었으며, 이는 베바시주맙의 분포 및 제거에서 유리체의 역할이 미미하다는 것을 시사합니다.

일단 숙달되면, 비판적 안구 분리 기법은 제대로 수행된다면 10분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 분자량과 같은 약동학 매개변수가 크게 다를 수 있으므로 토끼를 희생하고 안구를 접종하는 시점은 관심 약물에 따라 개별화되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 안구 약리학 분야의 연구자들이 토끼 눈에서 안구 내 약동학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 토끼 눈을 사용하여 안구 내 약동학 연구를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 동물 연구에서 얻은 유인 약동학적 특성을 인간에게 외삽할 때 토끼와 인간의 눈의 차이점을 신중하게 고려해야 한다는 것을 잊지 마십시오.